牛源性肺炎克雷伯菌噬菌體的分離鑒定及生物學特性分析

梁冰純，趙文鵬，石玉祥，朱春燕，韓 博，高 健

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038；3.上海市農產品質量安全中心，上海 青浦 201708)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是引起奶牛乳房炎的常見環境性病原菌。肺炎克雷伯菌乳房炎通常癥狀嚴重，難以治療，給奶牛養殖業造成巨大經濟損失[1]。目前主要使用抗菌藥治療這類乳房炎，然而，肺炎克雷伯菌對抗菌藥(如四環素)耐藥率較高的問題不容忽視[2]。因此，尋找合適的抗菌藥替代物治療此類乳房炎是未來發展的趨勢。噬菌體是感染細菌、真菌和藻類等微生物的病毒，分為溶源性噬菌體和裂解性噬菌體，其來源廣泛、無耐藥、無殘留、特異性強，對病原微生物以外的細胞無影響，并且已應用于食品加工、動植物養殖、醫療保健和生態環境等多個領域[3-6]。相關研究已經證實，噬菌體對金黃色葡萄球菌乳房炎有較好的治療效果[7]，因此，噬菌體有望成為治療奶牛乳房炎的抗菌藥替代品。但是，由于噬菌體特異性強，且大多數噬菌體感染細菌的裂解范圍較窄，因此有必要研發出由具有較寬裂解范圍的噬菌體產品，如噬菌體雞尾酒和工程噬菌體[8]。本試驗旨在針對乳房炎源性肺炎克雷伯菌，從污水樣品中誘導分離噬菌體，并對其進行生物學特性分析，為奶牛乳房炎治療中噬菌體產品的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及耗材 LB營養瓊脂、LB肉湯、腦心浸液(BHI)，均購自北京奧博星生物技術有限公司；SM緩沖液(主要由硫酸鎂、氯化鈉、明膠等組成)，購自北京酷來搏科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaq PCR Super Mix、DNA Marker、離心管、細胞凍存管和平皿，均購自北京華佰泰生物科技有限公司；瓊脂糖粉，購自北京索萊寶生物技術有限公司。

1.2 樣品采集 從河北省某規模化奶牛場不同圈舍中的糞尿蓄積池采集48份污水樣品，用于分離噬菌體。

1.3 肺炎克雷伯菌菌株 在本實驗室經鑒定、保存的肺炎克雷伯菌[9]中，選擇1株(HLJ-3)作為宿主菌，用于誘導分離噬菌體；另選擇來源于21個規模化奶牛場的44株肺炎克雷伯菌，與HLJ-3菌株一起，用于裂解譜的測定。所有菌株均凍存于-80 ℃，備用。

1.4 噬菌體分離及純化 將凍存的肺炎克雷伯菌(HLJ-3)接種于LB瓊脂平板，37 ℃下培養24 h。挑取單個菌落接種于BHI液體培養基，37 ℃、220 r/min振蕩過夜培養。將污水樣品10 000 r/min離心10 min，經0.22 μm微孔濾器過濾上清液。分別各取200 μL濾液和新鮮菌液加至3 mL LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養15 h。選擇較為清澈的培養基，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜過濾上清液，將濾液置于4 ℃保存。用SM液稀釋噬菌體原液，分別取40 μL不同稀釋梯度噬菌體原液與適量菌液，加入適量LB半固體培養基充分混合，鋪雙層板并置于37 ℃恒溫箱培養2～4 h。挑取大小一致的噬菌斑并加入適量菌液接種于適量LB液體培養基中37 ℃振蕩過夜培養。將培養液10 000 r/min離心5 min，經0.22 μm微孔濾器過濾上清液，重復3次，即得到純化噬菌體原液，4 ℃保存。采用雙層瓊脂平板法觀察噬菌斑。

1.5 噬菌體超微結構觀察 吸取純化后的噬菌體懸液20 μL(濃度為109PFU/mL)加至電鏡專用銅網上，室溫下靜置2 min。用2%醋酸鈾染色1 min，干燥后，通過透射電子顯微鏡觀察噬菌體超微結構。

1.6 噬菌體滴度測定 用SM溶液梯度稀釋純化的噬菌體原液。分別從不同梯度噬菌體稀釋液和新鮮肺炎克雷伯菌液中各吸取40 μL液體，并加至5 mL LB半固體培養基中充分混合，快速倒于LB固體培養基平皿中，置于37 ℃恒溫箱中培養 2～4 h，統計噬菌斑數量，計算噬菌體滴度。

噬菌體滴度(PFU/mL)=噬菌斑數×稀釋倍數×10

1.7 噬菌體最佳感染復數(MOI)測定 將噬菌體純化液和對數生長期的肺炎克雷伯菌液按噬菌體滴度(PFU/mL)/細菌濃度(CFU/mL)為 0.01、0.1、1、10 和 100充分混合，37 ℃孵育5 min，8 000 r/min離心5 min，棄上清留沉淀。重懸沉淀，置于適量LB液體培養基中37 ℃、220 r/min振蕩培養2 h，再12 000 r/min離心1 min，保存上清液。之后按1.6的方法測定噬菌體滴度，滴度最高者即為該株噬菌體MOI。

1.8 噬菌體裂解譜檢測 按1.6的方法，分別從45株對數生長期肺炎克雷伯菌中吸取100 μL菌液鋪設雙層平板，靜置2～5 min，再取5 μL噬菌體懸液滴于雙層平板上，置于37 ℃恒溫箱中過夜培養，觀察有無噬菌斑形成。

1.9 噬菌體一步生長曲線測定 在最佳MOI條件下，分別各吸取40 μL噬菌體純化液和對數生長期肺炎克雷伯菌液于20 mL LB液體培養基中充分混合，37 ℃孵育5 min，12 000 r/min離心1 min，棄上清并重懸沉淀，重復該步驟2～3次。將最后1次得到的沉淀置于20 mL LB液體培養基中，220 r/min振蕩培養2 h，每隔10 min取樣1次。收集所得到的樣品，12 000 r/min離心5 min，保存上清液并按1.6的方法測定噬菌體滴度。以感染時間為橫坐標，噬菌體滴度為縱坐標，繪制一步生長曲線，并判斷噬菌體的潛伏期和裂解期。

1.10 噬菌體酸堿穩定性和熱穩定性測定 取100 μL噬菌體純化液分別加至900 μL不同pH的PBS中(pH 2.0～12.0)，37 ℃孵育2 h。將不同pH的培養液按1.6的方法測定噬菌體滴度，并繪制噬菌體酸堿穩定性曲線。將同一噬菌體純化液平均分為5份，分別在30、40、50、60 ℃和70 ℃的水浴鍋內孵育90 min，每隔10 min取樣1次，將取得的樣品按1.6的方法，根據不同溫度和時間點噬菌斑的數量計算噬菌體滴度，并繪制噬菌體熱穩定性曲線。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌噬菌體的分離及純化 對分離得到的噬菌體進行富集純化培養，獲得1株肺炎克雷伯菌噬菌體，命名為SJT-2。由圖1可知，該株噬菌體可形成1～2 mm的邊緣整齊、大小一致且透明度高的噬菌斑。

圖1 噬菌體SJT-2的噬菌斑形態

2.2 噬菌體SJT-2超微結構觀察 由圖2可知，SJT-2主要由頭、頸以及尾部結構組成；其頭部呈現出多面體形態，長約100 nm，尾部長約116 nm，且有明顯的尾絲。

圖2 噬菌體SJT-2超微結構

2.3 噬菌體SJT-2 MOI測定 由圖3可知，MOI=0.1為SJT-2最佳感染復數，此時噬菌體具有最高滴度。

圖3 噬菌體SJT-2最佳感染復數

2.4 噬菌體SJT-2裂解譜檢測 在45株不同的肺炎克雷伯菌中，SJT-2能夠裂解其中的33株，裂解率為73.3%。

2.5 噬菌體SJT-2一步生長曲線測定 由圖4可知，SJT-2感染宿主菌在不同時間呈現不同滴度，其中，在0～20 min時為噬菌體潛伏期，噬菌體數量并無明顯變化；在20～50 min時為噬菌體爆發期，噬菌體數量急劇上升；在50～120 min時為噬菌體穩定期，噬菌體數量并無顯著變化。

圖4 噬菌體SJT-2一步生長曲線

2.6 噬菌體SJT-2酸堿穩定性測定 由圖5可知，SJT-2在不同酸堿度中的活性存在顯著差異。其中，pH為2.0時，SJT-2喪失活性；pH為3.0～4.0時，SJT-2具有一定活性；pH為4.0～8.0時，SJT-2滴度呈上升趨勢，活性逐步增強；pH為8.0時，SJT-2滴度最高，活性最強；pH為9.0～12.0時，SJT-2滴度呈下降趨勢，活性逐步減弱。

圖5 噬菌體SJT-2酸堿穩定性

2.7 噬菌體SJT-2熱穩定性測定 由圖6可知，在過高或過低的培養溫度下，SJT-2的活性存在較大差異。其中，在30 ℃時，SJT-2滴度并無明顯變化；隨著培養溫度的升高和作用時間的延長，SJT-2滴度呈下降趨勢。在70 ℃時，SJT-2滴度急劇下降，到作用20 min時SJT-2基本喪失活性。

圖6 噬菌體SJT-2熱穩定性

3 討論

噬菌體在自然環境中普遍存在，由于其特異性較強，需要通過相應的宿主菌分離對應的噬菌體。本試驗以奶牛場污水樣品為底物，通過具有較強耐藥性的臨床乳房炎源性肺炎克雷伯菌分離獲得1株裂解性噬菌體，命名為SJT-2。該株噬菌體可在LB半固體培養基中形成1～2 mm完全透明的噬菌斑。透射電鏡觀察發現，該株噬菌體由頭、頸以及尾部構成，頭部形態規則，呈多面體結構；尾部較長，初步判斷為長尾科噬菌體。該株噬菌體與已報道的肺炎克雷伯菌噬菌體KpJH46Φ2和ST258具有不同形態[10-11]，說明從不同環境條件中可以得到不同的噬菌體。

通常，裂解性噬菌體首先識別宿主菌表面受體并結合，向宿主菌體內注入核酸，利用細菌內遺傳物質進行自身的復制與增殖，最后通過裂解酶和穿孔素釋放子代噬菌體。其中噬菌體增殖特點表現為“一步生長”[12]，與細菌二分裂式指數生長增殖形式具有明顯差異[13]。噬菌體活性受溫度、酸堿度、紫外線以及其他有害因子的影響較大，因此會根據治療需求采用不同的給藥方式，保證噬菌體制劑的功效[14]。本試驗發現，SJT-2潛伏期較短、裂解能力較強，耐高溫，耐堿不耐酸。其中，在50～60 ℃培養90 min后SJT-2仍具有一定活性，在70 ℃下培養20 min后SJT-2完全失活；在pH為8.0時SJT-2具有最高滴度。

綜上所述，本試驗通過奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌獲得的噬菌體SJT-2裂解譜較寬、裂菌能力較強，且具有耐高溫、耐堿的生物學特性，適合作為研發臨床治療產品的基礎株。