雞白細胞介素18單克隆抗體的制備與鑒定

鄭孟加，馬 萌，王永強，高 麗，曹 紅，李淑芹，李曉齊，鄭世軍

(中國農業大學動物醫學院 農業農村部動物流行病學重點實驗室，北京 海淀 100193)

1995年，Okamura等從中毒休克的小鼠肝臟中分離到1種可以誘導Th細胞和NK細胞產生γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)的物質，被稱為IFN-γ誘生因子(IFN-gamma-inducing factor,IGIF)[1]。1996年，Ushio等將其正式命名為白介素18(Interleukin-18,IL-18)[2]。IL-18是重要的免疫調節分子，通常以前體的狀態存在于細胞內部，當機體受到細菌或病毒刺激時，其前體會被炎性小體切割形成有活性的IL-18并釋放到胞外[3]，因此IL-18可以作為檢測炎性小體介導的細胞焦亡的重要指標，也是檢測先天性免疫應答炎癥反應的重要指標。雞IL-18與人和小鼠IL-18氨基酸同源性分別為34%和27%，目前國內外用于檢測chIL-18的商品化單克隆抗體或試劑盒較為罕見。為此，本試驗制備了抗chIL-18單克隆抗體，為深入研究chIL-18的生物學功能及炎性小體細胞焦亡的檢測打下基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、細菌種類、蛋白、細胞類型和實驗動物 pGEX-6p-1、pET-28a兩種質粒，大腸埃希菌(E.coli)BL21/DH5α，標簽蛋白His-IL-1、His-IFN-β、His-IL-10，骨髓瘤細胞SP2/0，均為本實驗室留存；6～8周齡BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2021—0006。

1.2 主要試劑與儀器設備 限制性內切酶，購自NEB公司；DNA膠回收試劑盒，購自Zymo公司；DNA連接酶和蛋白Marker,購自TaKaRa有限公司；Ni-NTA親和純化柱,購自德國Qiagen公司；凝膠Glutathione Sephrose 4B，購自GE Healthcare BioSciences AB公司；質粒快速提取試劑盒，購自北京艾德萊公司；鼠源抗His、GST單克隆抗體，購自Abmart公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG，購自鼎國昌盛公司；弗氏完全/不完全佐劑、HAT、HT、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鑒定試劑盒、DMEM粉劑、胎牛血清、DMSO和HEPES，均購自Cibco公司。凝膠成像分析儀，購自美國Alpha公司；96孔酶標儀，購自TECAN公司；低溫冷凍高速離心機，購自Eppendorf公司。

1.3 chIL-18重組質粒的構建及蛋白表達 根據NCBI上發表的chIL-18的序列(GenBank ID：AJ277865.1)設計特異性引物：F1(5′-ATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R1(5′-TCATAGGTTGTGCCTT-TCATTA-3′)，以感染沙門菌的雞脾細胞制備的cDNA為模板，擴增chIL-18基因；將擴增得到的特異性條帶回收后連接至T載體，并設計含有BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點的特異性引物F2(5′-GGATCCATGAGCTGTGAAGAGATCGC-3′)、R2(5′-CTCGA-GTCATAGGTTGTGCCTTTCAT-3′)，以測序正確的質粒為模板對chIL-18基因進行擴增；利用雙酶切方法將chIL-18基因連接到pET-28a和pGEX-6p-1載體上，轉入大腸埃希菌DH5α，隨后對重組質粒進行PCR擴增和測序鑒定。將構建成功的重組質粒分別轉導入大腸埃希菌BL21中，加入IPTG對其進行誘導表達，對產生的蛋白進行SDS-PAGE和Western blot鑒定，隨后利用親和層析法純化鑒定正確的蛋白，高純度的2種蛋白分別用作小鼠免疫和陽性雜交瘤細胞篩選的抗原。

1.4 chIL-18單克隆抗體的制備與純化 免疫小鼠3次后，以間接ELISA方法檢測小鼠chIL-18陽性血清效價水平，效價足夠高的小鼠脾細胞可用來進行細胞融合。小鼠免疫程序參照參考文獻[4]進行，細胞融合、陽性雜交瘤篩選過程參照參考文獻[5]進行。單抗的大量制備與純化參照參考文獻[6]所述方法進行。

1.5 chIL-18單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體亞型的鑒定 按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents說明書測定單克隆抗體亞型。

1.5.2 單克隆抗體親和力的鑒定 利用間接ELISA方法測定單克隆抗體的親和力，以1 μg/mL重組蛋白GST-chIL-18為包被抗原，將待檢測的單克隆抗體加入其中，二抗為HRP標記的山羊抗小鼠IgG，使用酶標儀測定OD450處吸光值。數據的計算和分析參照參考文獻[7]的方法進行。

1.5.3 單克隆抗體交叉反應性的鑒定 以原核系統表達的His-chIL-18、His-chIL-1、His-chIL-10、His-IFN-β蛋白為抗原，一抗以制備好的2株chIL-18單克隆抗體和His-tag單克隆抗體，二抗使用HRP標記的山羊抗小鼠IgG進行Western blot試驗，檢測單抗的交叉反應性。

1.5.4 單克隆抗體抗原識別區域的鑒定 分別以chIL-18 N端第57位和第113位氨基酸為截點，構建3個chIL-18的截短重組質粒。以大腸埃希菌 BL21中誘導表達的截短蛋白為抗原，以制備的chIL-18單克隆抗體為一抗，使用Western blot方法鑒定2株單克隆抗體的氨基酸識別區域。

2 結果

2.1 chIL-18重組質粒的構建及蛋白表達 所構建的重組質粒經PCR鑒定、基因測序，所得結果與預期一致(圖1A～1C)。重組質粒在E.coliBL21中誘導表達后，經SDS-PAGE分析(圖1D和1E)及Western blot鑒定(圖1F和1G)，確定His-chIL-18和GST-chIL-18重組蛋白均在預期目的蛋白大小處有表達。

圖1 重組質粒的構建與蛋白的表達

2.2 chIL-18單克隆抗體的制備與純化 免疫小鼠3次后，測定小鼠血清中chIL-18抗體效價達到1∶64 000。經過細胞融合、陽性雜交瘤篩選、亞克隆等過程，篩選到2株穩定分泌chIL-18蛋白抗體的雜交瘤細胞株，將其分別稱作2A7和2G5。將篩選的雜交瘤細胞注射進小鼠腹腔中，利用鹽析法和親和層析法對抽取后的腹水進行純化，得到高純度的單克隆抗體(圖2)。

圖2 單克隆抗體的純化

2.3 chIL-8單克隆抗體的鑒定

2.3.1 單克隆抗體亞型的鑒定 使用 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 試劑盒檢測，結果顯示2株單克隆抗體的亞型均是IgG1型。

2.3.2 單克隆抗體親和力的鑒定 利用間接ELISA方法對單抗的親和力進行鑒定，結果顯示2A7和2G5的親和力解離常數(Kd)分別為4.4×10-12和2.06×10-10(圖3)，表明親和力良好。

圖3 單克隆抗體2A7(A)和2G5(B)親和力的鑒定

2.3.3 單克隆抗體交叉反應性的鑒定 使用Western blot檢測方法測定單抗對原核系統表達的其他細胞因子識別情況，結果顯示2株單抗都能識別His-chIL-18，但是不識別帶有His標簽的chIL-1、chIL-10、chIFN-β的蛋白，無交叉反應性(圖4)。

圖4 單克隆抗體交叉反應性的鑒定

2.3.4 單克隆抗體抗原識別區域的鑒定 抗原為mchIL-18截短蛋白，一抗為制備單克隆抗體，使用Western blot方法確定單克隆抗體的氨基酸識別區域。結果顯示，2A7和2G5分別識別mchIL-18蛋白N端的第57～113位和第114～169位氨基酸(圖5)。

圖5 單克隆抗體抗原識別區的鑒定

3 討論

人和小鼠IL-18成熟蛋白均由157個氨基酸組成，無信號肽和糖基化位點，它們之間氨基酸同源性為60%[8-9]。chIL-18基因位于第24號染色體上，成熟蛋白由169個氨基酸組成，與人和小鼠等哺乳動物相比肽鏈較長，其功能與人IL-18相似[10]。經分析，chIL-18與人IL-18和小鼠IL-18氨基酸同源性僅分別為34%和28%，因此推測chIL-18抗體不能識別哺乳動物的IL-18蛋白。

獲得的2株雜交瘤均分泌高親合力抗體，而高親和力抗體識別不同抗原表位是制備夾心ELISA試劑盒的必備條件。抗原表位是由5～7個氨基酸組成的特殊化學基團[11]，為了鑒定單抗的抗原識別區，本試驗構建了chIL-18的3個截短蛋白，分別為chIL-18的1～57 aa、58～113 aa和114～169 aa，結果表明這2株抗體可以識別不同的抗原表位，這為chIL-18雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立和深入研究家禽先天性免疫炎癥反應提供了有價值的手段。