河南省雞源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

呂玉金，艾夢燕，宋予震，周佳淑，王 聰，吳鳳筍，李文剛，彭 忠，陳煥春，王湘如

(1.河南牧業經濟學院動物醫藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南農業大學動物醫學院，河南 鄭州450002；3.華中農業大學動物醫學院，湖北 武漢 430070)

雞源大腸桿菌病是危害養雞業的常見細菌性傳染病，發病率和死亡率都比較高，經濟損失巨大。臨床上預防和治療雞源大腸桿菌感染主要依賴抗菌藥，由于抗菌藥不規范使用，導致出現耐藥菌株，造成藥物殘留問題，危害公共衛生安全。有研究表明，大腸桿菌的毒力因子包括黏附素、攝鐵系統、侵襲素和血清抗性等[1]。大腸桿菌的毒力與其所攜帶毒力因子的數量具有顯著的相關性[2-4]。一般而言，大腸桿菌攜帶的毒力基因數量越多，其毒力越強[5]。我國大腸桿菌耐藥情況調查表明，畜禽體中所攜帶的大腸桿菌耐藥性十分嚴峻，張海龍[6]通過對河北省2018—2020年雞源大腸桿菌進行耐藥性檢測，結果發現，分離菌株對阿莫西林、強力霉素、復方新諾明、林可霉素等藥物的耐藥率達70%以上，并呈現逐年增長的趨勢；徐亞亞等[7]研究發現，50%的大腸桿菌分離株耐受13種藥物，對強力霉素、氨芐青霉素、四環素等抗菌藥物的耐藥率均已經超過了80%。耐藥性菌株的出現，增加了致病性大腸桿菌的治療難度，因此，本試驗通過對河南省雞源大腸桿菌致病性及耐藥性進行檢測，以期為其防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 采集河南省30個規模化養雞場病死雞的盲腸、肝臟、心臟等共430份樣品。

1.2 主要試劑及儀器 伊紅美藍培養基、LB肉湯，均購自北京陸橋技術有限公司；綠如藍核酸染料，購自北京天恩澤基因科技有限公司；藥敏紙片，購自北京普納德科技有限公司。恒溫培養箱(DHP-9272)，上海百典儀器有限公司；PCR儀(ETC-811)，東勝興業科學儀器有限公司；電泳儀(DYY-10C)，北京六一儀器廠。

1.3 大腸桿菌的分離純化與PCR鑒定 在無菌條件下，將采集的430份組織樣品進行研磨處理，分別加入3 mL LB肉湯，37 ℃搖床振蕩培養16～18 h，采用三區劃線法劃線接種于伊紅美藍培養基上，挑選黑色、帶有金屬光澤、邊緣整齊、表面光滑、凸起的圓形菌落進行純化。采用PCR擴增16S rDNA基因的方法進行大腸桿菌的鑒定，擴增引物信息見表1。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 大腸桿菌16S rDNA鑒定引物

1.4 大腸桿菌毒力基因鑒定 采用參考文獻[8]中引物序列及多重PCR體系分別擴增17種毒力相關基因，引物信息見表2。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表2 大腸桿菌17種毒力基因鑒定引物

1.5 大腸桿菌耐藥性檢測 采樣K-B紙片法對分離的大腸桿菌進行藥敏試驗，受試藥物包括頭孢哌酮(CFP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑啉(KZ)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、卡那霉素(K)、鏈霉素(S)、阿莫西林(AML)、環丙沙星(CIP)、四環素(TE)、諾氟沙星(NOR)、復方新諾明(STX)、氯霉素(C)、克林霉素(DA)、新霉素(N)、大觀霉素(SPC)、氨芐西林(AMP)、多西環素(DOX)、氧氟沙星(OFX)和恩諾沙星(ENR)共21種藥物，參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準(第30版)進行抗微生物藥物敏感結果判定。

1.6 大腸桿菌耐藥基因檢測 對大腸桿菌進行耐藥基因檢測，包括qnrB、floR、sul3、sul2、blaNDM-1、blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、mcr-1、blaVIM、tetA、blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和cfr共15種耐藥基因，采用PCR方法進行鑒定，引物序列、反應體系和反應程序參照參考文獻[9]。

2 結果

2.1 大腸桿菌的PCR鑒定 分離純化后通過PCR方法擴增16S rDNA基因，結果顯示，從430份樣品中分離鑒定出374株大腸桿菌，分離率為86.98%，見圖1。

圖1 部分大腸桿菌16S rDNA的PCR鑒定

2.2 大腸桿菌毒力基因鑒定 毒力基因的檢測結果顯示，17種待檢毒力基因中yijp、ompA、fimC、mat基因的檢出率高達90.00%以上，ibeB、iss、iroN、iucD基因的檢測率在50.00%～80.00%，aatA、tsh、cvaC、fyuA、irp2、chuA基因的檢出率在10.00%～50.00%，neuC基因的檢出率為0，其他毒力基因檢出率低于10.00%(圖2)；分析不同菌株所含毒力基因的種類，結果顯示，136株大腸桿菌分離株所含毒力基因種數在10種及以上，占比為36.36%；134株大腸桿菌分離株攜帶8～9種毒力基因，占比為 35.83%；104株大腸桿菌分離株攜帶7種及以下毒力基因，占比為27.81%(圖3)；在攜帶10種以上毒力基因的136株大腸桿菌分離株中，108株攜帶了tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2毒力基因中的3種及以上(圖4)，被界定為致病性大腸桿菌[5]。

圖2 大腸桿菌毒力基因分布情況

圖3 374株大腸桿菌攜帶17種毒力基因情況

圖4 136株大腸桿菌攜帶6種毒力基因情況

2.3 大腸桿菌耐藥性檢測 對108株致病性大腸桿菌進行藥物敏感性測試和耐藥譜分析。藥敏試驗結果顯示：其中90.00%以上的分離株對氨芐西林、阿莫西林、克林霉素耐藥，80.00%～90.00%的分離株對四環素、氯霉素、頭孢唑啉、復方新諾明耐藥，36.11%的分離株對諾氟沙星表現出耐藥性(圖5)。耐藥譜分析結果顯示，其中8株致病性大腸桿菌對20種受試藥物表現耐藥，占比7.41%；57株致病性大腸桿菌針對15～19種受試藥物表現出耐藥性，占比52.78%；27株致病性大腸桿菌耐藥種數介于10～14種，占比25.00%；16株致病性大腸桿菌耐藥種數為9種及以下，占比14.81%，在這16株致病性大腸桿菌中，有13株耐藥種數在3種及以上(圖6)。

圖5 大腸桿菌對不同抗菌藥的耐藥率

圖6 大腸桿菌耐藥種數

2.4 大腸桿菌耐藥基因檢測 檢測108株致病性大腸桿菌中15種耐藥基因的攜帶情況。結果顯示：sul2(87.04%)、tetA(87.96%)、blaCTX-M(75.93%)這3種耐藥基因的檢出率較高，均達到了70.00%以上；blaTEM基因檢出率為51.85%；未檢測出qnrB、blaKPC、blaIMP、blaSHV和cfr這5種耐藥基因(表3)。在檢測的15種耐藥基因中，單菌株檢出的耐藥基因種數最少為0種，有1株大腸桿菌，占比為0.93%；檢出的耐藥基因種數最多為7種，有3株大腸桿菌，占比為2.78%；其中攜帶4種耐藥基因的菌株數量最多，有27株大腸桿菌，占比為25.00%；攜帶5～6種耐藥基因的菌株占比介于15.00%～20.00%(圖7)。

表3 大腸桿菌耐藥基因檢出率

圖7 大腸桿菌攜帶耐藥基因種數

3 討論

本試驗從河南省部分養雞場采集430份樣品，經細菌分離純化、PCR鑒定后共獲得374株大腸桿菌，分離率為86.98%，結果與我國其他學者的報道一致。如盧曉輝等[10]2009年報道河南省養雞場大腸桿菌的分離率為78.62%；毛福超等[11]2016年報道豫西地區養雞場大腸桿菌的分離率為75.38%；艾偉昌等[12]2018年報道河南省某規模化養雞場大腸桿菌的分離率為83.3%。上述結果均提示，養雞場中大腸桿的分離率較高，應注意加強針對該病原菌的防控工作。

本試驗針對分離到的374株雞源大腸桿菌進行毒力基因鑒定。在所檢測的17種毒力基因中，yijp、ompA、fimC、mat的檢出率高達90.00%以上，但neuC的檢出率為0；此外，超過36.36%(136/374)的大腸桿菌分離株所攜帶的毒力基因種類在10種及以上。高麗等[13]從黑龍江省大慶地區分離鑒定出的53株大腸桿菌中，48株含有毒力基因，其中氣桿菌素iucD基因占91.0%、強毒力島fyuA基因占51.3%、外膜蛋白ompA基因占89.0%，而本試驗中，iucD基因占76.20%、fyuA基因占23.80%、ompA基因占95.19%。王俊麗等[8]進行的大腸桿菌毒力基因檢測中，yijp、fimC、mat、ompA、ibeB、iroN這6種毒力基因的陽性率超過了50%，aatA、tsh、vat、cvaC、iss、iucD、irp2這7種毒力基因陽性率在20%～49%，而本試驗中，除yijp、fimC、mat、ompA、ibeB、iroN這6種基因陽性率超過50.00%，iss、iucD基因的陽性率也超過了50.00%，但本試驗vat基因的陽性率只有3.21%。王俊麗等[8]進行的試驗中攜帶10種及以上毒力基因的比例為10%，而本試驗菌株攜帶10種及以上毒力基因占比為36.36%。張立偉等[14]分離的雞源大腸桿菌的fimC和ompA基因的攜帶率為100%，aatA、yijP、irp2、mat、iss等基因的檢出率也達到了90%以上，本試驗中yijp、ompA、fimC、mat基因的檢出率在90.00%以上，而aatA、irp2、iss這3種基因的檢出率與其不一致。綜上所述，大腸桿菌在不同地區之間的差異較大。雞源大腸桿菌攜帶的毒力基因的數量與其致病性呈正相關，當菌株中攜帶tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2這6種毒力基因中的3種及以上時為致病性大腸桿菌[2,5]。基于此報道，本試驗中共有108株分離株可被界定為致病性大腸桿菌。

針對108株致病性大腸桿菌的藥敏試驗結果顯示，90.00%以上的致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、克林霉素這3種抗菌藥耐藥，有8株大腸桿菌的耐藥種類均達到了20種。2010年，李昆明等[15]對分離出的雞源大腸桿菌進行24種抗菌藥的耐藥情況檢測，其中鏈霉素、四環素、氯霉素等10種藥物的耐藥率達90%，且有21種抗菌藥的耐藥率大于70%；2016年，毛福超等[11]從豫西地區養雞場分離得到的大腸桿菌，對20種抗菌藥的耐藥性的檢測結果顯示，分離的大腸桿菌對復方新諾明、四環素、氨芐西林這3種抗菌藥的耐藥率依次遞減，20種抗菌藥中耐藥最多的大腸桿菌有18種耐藥，9～14種耐藥占77.55%；2018年，艾偉昌等[12]從河南省某規模化養雞場分離得到的大腸桿菌，對四環素、氨芐西林、復方新諾明等抗菌藥耐藥嚴重，耐藥率均在80%以上，對20種藥物產生耐藥的菌株占7.41%，對15～19種藥物產生耐藥的菌株占52.78%。

本試驗對分離出的108株致病性大腸桿菌進行耐藥基因的檢測，發現sul2、tetA、blaCTX-M這3種耐藥基因檢出率分別為87.04%、87.96%、75.93%，blaTEM檢出率為51.85%，qnrB、blaKPC、blaIMP、blaSHV和cfr這5種耐藥基因檢出率為0，幾乎所有的菌株都含有2種以上的耐藥基因，有的菌株含高達7種耐藥基因。此次試驗中磺胺類耐藥基因sul2、四環素類耐藥基因tetA、β-內酰胺類耐藥基因blaCTX-M與其相對應的耐藥表型結果一致，但氯霉素類耐藥基因floR與其耐藥表型不一致，主要原因在于floR基因主要介導氟苯尼考的耐藥機制，而氯霉素的耐藥機制由cat基因介導。

本試驗從河南省30個規模化雞場分離出374株大腸桿菌，其中108株大腸桿菌所含毒力基因種類在10種及10種以上，且其攜帶tsh、cvaC、iss、iroN、iucD、irp2這6種基因中的3種及以上，因此判定為致病性大腸桿菌。108株致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、克林霉素3種抗菌藥的耐藥率達90.00%以上。在耐藥基因檢測中，sul2(87.04%)、tetA(87.96%)、blaCTX-M(75.93%)這3種耐藥基因檢出率較高，且與其相對應的耐藥表型結果一致。由此可見，大腸桿菌的耐藥問題較為嚴重，篩選替抗產品應用于雞源大腸桿菌病的防治尤為重要，本試驗對于了解河南地區雞源大腸桿菌的流行及耐藥性具有一定的參考價值。