嗜鹽單胞菌利用乙酸鹽合成PHB的研究

晉 彪張 靜洪坤強(qiáng)王智文陳 濤?

嗜鹽微生物(Halophiles)是六大極端微生物的一種[1],其正常的生長(zhǎng)需要較高的鹽濃度來維持。相比于其他常見底盤微生物,嗜鹽菌的高耐鹽特性使其在培養(yǎng)過程中不易染菌,可以進(jìn)行不嚴(yán)格的滅菌發(fā)酵[2],下游提取胞內(nèi)PHB 產(chǎn)物時(shí),加入適量清水即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破壁,在節(jié)約能耗的同時(shí),也簡(jiǎn)化了發(fā)酵工藝。 但嗜鹽微生物的遺傳背景不清晰、基因編輯難度大制約了其發(fā)展。 自新疆艾丁湖分離純化得到的嗜鹽菌TD01(Halomonassp. TD01),最適生長(zhǎng)溫度37 ℃,最適生長(zhǎng)鹽濃度為60 g·L-1NaCl,最高可耐受250 g·L-1NaCl,是1 株中度嗜鹽菌并可天然生產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)[3]。 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)[4]、組成型啟動(dòng)子庫(kù)PPorin[5]、誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)[6]等基因編輯手段在Halomonassp. TD01 中的成功應(yīng)用,為其作為下一代工業(yè)生物技術(shù)的底盤細(xì)胞打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是一類由含羥基脂肪酸單體聚合而成的生物大分子聚合物,無毒無害可再生,具有生物相容性、可降解性和良好的物化特性[7],在生物塑料[8]、藥物緩釋載體、植入性材料[9]等領(lǐng)域擁有廣泛前景[10]。 聚3-羥基丁酸酯由3-羥基丁酸聚合而成,是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單,研究最清楚的PHA。

乙酸作為一種二元弱酸,不僅常作為生物發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物,還廣泛存在于各種纖維素水解液中[11]。 乙酸鈉的價(jià)格比葡萄糖每噸低150 美元左右[12],研究表明,利用廉價(jià)的乙酸鹽代替葡萄糖進(jìn)行如異丙醇[13]、乙醇酸[14]等高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)是具有一定潛力的。 但高濃度的乙酸根和鹽離子會(huì)抑制菌體生長(zhǎng),降低產(chǎn)量和產(chǎn)率,因此提高工程菌株對(duì)乙酸鹽的耐受和利用效率至關(guān)重要。

本研究測(cè)試發(fā)現(xiàn)Halomonassp. TD1.0 具有天然耐受高濃度乙酸鈉的優(yōu)勢(shì),并可利用乙酸高效合成PHB。 隨后我們通過過表達(dá)枯草芽孢桿菌來源的乙酰輔酶A 合成酶(ACS)進(jìn)一步提高了菌株的乙酸利用速度和PHB 產(chǎn)量,并初步研究了ACS 的表達(dá)對(duì)TD1.0 利用葡萄糖和乙酸鈉混合碳源進(jìn)行代謝的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基:5 g·L-1酵母抽提物,10 g·L-1胰蛋白胨,10 g·L-1氯化鈉,pH=7.0。 需要時(shí)額外添30 μg·mL-1相應(yīng)抗生素。 固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

20LB 培養(yǎng)基:LB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上把氯化鈉濃度提到20 g·L-1。

60LB 培養(yǎng)基:LB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上把氯化鈉濃度提到60 g·L-1,pH 值調(diào)至9.0。

60MMG 發(fā)酵培養(yǎng)基:60 g·L-1NaCl,1 g·L-1酵母抽提物,20 g·L-1葡萄糖或27.3 g·L-1NaAC,9.85 g·L-1Na2HPO4·12H2O,1.5 g·L-1KH2PO4,1 g·L-1NH4Cl,0.4 g·L-1MgSO4·7H2O,0.05 g·L-1Fe(Ⅲ)-NH4-Citrate,0.02 g·L-1CaCl2·2H2O,0.1 mg·L-1Zn-SO4·7H2O,0.03 mg·L-1MnCl2·4H2O,0.3 mg·L-1H3BO3,0.2 mg·L-1CoCl2·6H2O,0.01 mg·L-1CuSO4·5H2O,0.02 mg·L-1NiCl2·6H2O,0.03 mg·L-1NaMoO4·2H2O。

1.3 引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)見表2。

表2 引物設(shè)計(jì)Table 2 Primers used in this study

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建

一般高拷貝表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將枯草芽孢桿菌屬來源的acs基因序列,根據(jù)嗜鹽單胞菌的密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化,并由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因合成,合成的acs基因連接至pU17 獲得pU17-acs。 以 pU17-acs為模板, 采用引物 ACSPN59-M-F 和ACS-PN59-M-R,PCR 擴(kuò)增得到acs 片段(引物2 端分別帶有與質(zhì)粒骨架有互補(bǔ)的25 bp序列)。 以攜帶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PMmp1的高拷貝質(zhì)粒pN59-pSEVA341[16]為模板,采用引物PN59-M-ACSF 和PN59-M-ACS-R,PCR 擴(kuò)增得到質(zhì)粒骨架(2 端有25bp 與ACS 互補(bǔ)的序列)。 將得到的目標(biāo)片段和質(zhì)粒骨架,采用Gibson 組裝試劑盒(NEB 公司),進(jìn)行無縫融合。 誘導(dǎo)型低拷貝穿梭質(zhì)粒pN85-pSEVA321[17]以同樣的方法進(jìn)行構(gòu)建,基因acs的擴(kuò)增引物采用ACS-PN85-M-F 和ACS-PN85-M-R,質(zhì)粒pN85-pSEVA341 的擴(kuò)增引物采用PN85-M-ACS-F 和PN85-M-ACS-R。

1.5 接合轉(zhuǎn)化的方法

E. coliDH5α 的化轉(zhuǎn)和E. coliS17-1 的電轉(zhuǎn)方法參照Ma 等[17]方法。 接合轉(zhuǎn)化方法同Ye 等[18]。最終接合菌體用無抗60LB 重懸菌體后涂布到加有30 μg·mL-1氯霉素抗性的 60LB 平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,獲的單菌落進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證得到正確的轉(zhuǎn)化菌株。

1.6 提取總蛋白

取適量菌液,離心去上清,洗滌2 次,100 ℃煮10 min,離心取上清,進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.7 搖瓶發(fā)酵

將菌株在60LB 平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種至60LB,37 ℃,220 r·min-1下培養(yǎng)12 h,連續(xù)活化2 次。 最后將二級(jí)活化種子液接種到60 MMG(Glu/NaAC)發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)中,接種量為0.25(OD600),需要時(shí)添加30 μg·mL-1氯霉素抗性,和1 mmol·L-1誘導(dǎo)物IPTG(OD600為0.4～0.6 時(shí)添加),在37 ℃,220 r·min-1條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.8 發(fā)酵液分析與產(chǎn)物測(cè)定

細(xì)胞OD600值使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定。葡萄糖和乙酸鈉濃度使用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè),色譜柱型號(hào)HPX87H-安捷倫,流動(dòng)相為5 mmol·L-1H2SO4,流速0.5 mL·min-1,柱溫60 ℃,檢測(cè)器為示差 RID 檢測(cè)器。

細(xì)胞干質(zhì)量測(cè)量:取適量發(fā)酵菌體,離心去上清,- 80 ℃超低溫冰箱內(nèi)冷凍12 h,采用德國(guó)CHRIST 公司的冷凍干燥機(jī)凍干12 h,精密電子天平測(cè)量細(xì)胞干質(zhì)量。

PHB 產(chǎn)物分析:稱取20 mg 左右干菌體和適量PHB 標(biāo)品,置于耐高溫封閉性好的酯化管中,加入1.5 mL 酯化液(485 mL 甲醇,15 mL 濃硫酸,0.25 g苯甲酸)和1.5 mL 三氯甲烷,100 ℃酯化4 h。 向酯化后的體系中加入1 mL 雙蒸水,震蕩混勻,靜置分層,取下層有機(jī)相用于氣相色譜的檢測(cè)。 色譜條件為:N2載氣,H2燃燒氣體,流速30 mL·min-1,空氣400 mL·min-1,柱子為安捷倫HP-5,氣相程序:進(jìn)樣口溫度240 ℃,檢測(cè)器溫度250 ℃,初始溫度80 ℃,維持1.5 min,30 ℃·min-1升溫至140 ℃,40 ℃·min-1升溫至240 ℃,維持2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 TD1.0 對(duì)乙酸鈉的利用和耐受性測(cè)試

為表征嗜鹽單胞菌TD1.0 對(duì)乙酸鈉的利用和耐受能力,60 MMG 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以25、50、75、100 g·L-1的乙酸鈉代替葡萄糖為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)測(cè)試。 菌株在不同濃度乙酸鈉為碳源條件下的生長(zhǎng)曲線見圖1。

圖1 NaAC 耐受測(cè)試Fig.1 Tolerance of NaAC

由圖1 可知,TD1.0 在高濃度乙酸鈉(25 ～100 g·L-1)的碳源下均可以生長(zhǎng),其中在25 g·L-1乙酸鈉為碳源下長(zhǎng)勢(shì)最好,最高生物量達(dá)到了16.8(OD600)。 但隨著乙酸鈉濃度的提高,菌株生長(zhǎng)受到了抑制,濃度越高,抑制程度越明顯。 在生長(zhǎng)前期(12 h 內(nèi)),100 g·L-1乙酸鈉條件下,培養(yǎng)12 h OD600僅從0.25 長(zhǎng)到0.87,而此時(shí)以25 g·L-1乙酸鈉為碳源的菌株OD600已經(jīng)達(dá)到了5.48。 培養(yǎng)72 h,TD1.0 在100 g·L-1NaAC 中最大OD600為9.1,相比于在25 g·L-1乙酸鈉實(shí)驗(yàn)組,其生長(zhǎng)抑制率達(dá)到45.8%,而大多數(shù)微生物在乙酸鹽濃度超過 0.5 g·L-1時(shí),其生長(zhǎng)就會(huì)受到嚴(yán)重抑制[19]。 以上結(jié)果表明嗜鹽單胞菌TD1.0 具有天然的利用和耐受高濃度乙酸鈉的生理優(yōu)勢(shì),為后續(xù)開發(fā)嗜鹽單胞菌利用廉價(jià)的乙酸鹽代替葡萄糖生產(chǎn)相關(guān)化學(xué)品具有巨大潛力。

2.2 過表達(dá)ACS 對(duì)乙酸利用和PHB 合成的影響

在嗜鹽菌中,以葡萄糖和乙酸鈉為碳源合成PHB 的途徑如圖2 所示。 葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,乙酸鈉經(jīng)過乙酰-CoA 合成酶(ACS)得到乙酰輔酶A,其中一部分乙酰-CoA 進(jìn)入TCA 循環(huán),另一部分在乙酰-CoA 乙酰基轉(zhuǎn)移酶(PhaA)的作用下生成乙酰乙酰-CoA,繼而在3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶(PhaB)的作用下生成3-羥基丁酰-CoA,最終在聚羥基脂肪酸酯合成酶(PhaC)的作用下生成聚3-羥基脂肪酸酯(PHB)。

圖2 PHB 的生產(chǎn)途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of PHB

為進(jìn)一步強(qiáng)化嗜鹽單胞菌利用乙酸鈉的優(yōu)勢(shì),本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了以高拷貝acs表達(dá)載體pN59-M-ACS和低拷貝acs表達(dá)載體pN85-M-ACS。 通過接合轉(zhuǎn)化將2 種質(zhì)粒分別導(dǎo)入TD1.0 后得到菌株TDPN59 和TD-PN85,SDS-PAGE 分析的ACS 蛋白表達(dá)見圖3,TD-PN59 和TD-PN85 中ACS 蛋白(65 kDa)均可正常表達(dá),且高拷貝表達(dá)菌株TD-PN59 的ACS蛋白條帶較TD-PN85 更為明顯,表明表達(dá)載體拷貝數(shù)越高,ACS 的表達(dá)量就越多。

圖3 菌株TD-PN59 和TD-PN85 胞內(nèi)ACS 的PAGE 檢測(cè)Fig.3 ACS expression in strain TD-PN59 and TD-PN85

進(jìn)一步對(duì)TD-PN59 和TD-PN85 進(jìn)行乙酸鈉為單一碳源搖瓶生長(zhǎng)測(cè)試,其中乙酸鈉濃度為27.3 g·L-1為碳源,對(duì)照組以20 g·L-1葡萄糖(碳物質(zhì)的量等價(jià)于27.3 g·L-1乙酸鈉)為單一碳源。 以TD1.0 為對(duì)照菌株,以初始OD600=0.25 進(jìn)行接種,其中TD-PN59和TD-PN85 菌株在OD600長(zhǎng)至0.4 ～ 0.6 時(shí)添加1 mmol·L-1的IPTG 誘導(dǎo)ACS 表達(dá)。 37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng),間隔取樣測(cè)定碳源剩余量、生物量(OD600)(圖4)和胞內(nèi)PHB 產(chǎn)量(圖5)。

圖4 導(dǎo)入不同拷貝數(shù)ACS 菌株的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growing status of different strains

圖5 導(dǎo)入不同拷貝數(shù)ACS 菌株的CDW 和PHB 產(chǎn)量Fig.5 CDW and PHB content of different strains

由圖4 和圖5 可知,TD1.0 菌株以葡萄糖為碳源時(shí),前期生長(zhǎng)階段(<12 h),生長(zhǎng)迅速,優(yōu)于乙酸鈉,最高 OD600為26;以乙酸鈉為碳源雖前期生長(zhǎng)速度慢于葡萄糖,但培養(yǎng)12 h 后,乙酸鈉利用加快,最大值達(dá)到30.57(OD600),優(yōu)于葡萄糖為碳源的生長(zhǎng)(圖4)。 代謝葡萄糖的對(duì)照組pH 值從最初的9.0降到了6.3,代謝乙酸鈉的實(shí)驗(yàn)組pH 值仍維持在9.0 左右,這說明代謝葡萄糖會(huì)產(chǎn)生大量的酸性代謝副產(chǎn)物,對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[20],而代謝乙酸鈉時(shí)能維持堿性環(huán)境從而有利于細(xì)胞在發(fā)酵后期的生長(zhǎng)。 TD1.0 以葡萄糖為碳源在42 h 達(dá)到最大細(xì)胞干質(zhì)量(CDW),為9.87 g·L-1,PHB 產(chǎn)量為6.12 g·L-1,PHB 胞內(nèi)產(chǎn)物占比0.62 g/g(PHB/干菌體)。 以乙酸鈉為碳源時(shí),TD1.0 可在36 h 內(nèi)完全消耗完乙酸鈉,并在48 h 時(shí)達(dá)到9.6 g·L-1的最大細(xì)胞干質(zhì)量,PHB 產(chǎn)量和胞內(nèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.86 g·L-1和61%。

含高拷貝質(zhì)粒pN59-M-ACS 的菌株TD-PN59約30 h 消耗完乙酸鈉,并在36 h 時(shí)達(dá)到31.5 的最大細(xì)胞OD600值,發(fā)酵過程中的最大和平均乙酸鹽利用速率為1.47 (9～12 h)和 0.91 g·L-1·h-1,比TD1.0 分別提高 37.4%[1.07 g·L-1·h-1(9～12 h)]和19.7%(0.76 g·L-1·h-1)。 菌株TD-PN59 的細(xì)胞干質(zhì)量也有輕微提升,發(fā)酵42 h 時(shí)達(dá)到9.98 g·L-1,PHB 的產(chǎn)量和胞內(nèi)含量分別為6.49 g·L-1和65%,PHB 產(chǎn)量相比于TD1.0 利用乙酸鈉為碳源提高(5.86 g·L-1)了約11%,比TD1.0 利用葡萄糖為碳源(6.12 g·L-1)提高了約6%。 含低拷貝質(zhì)粒pN85-M-ACS 的菌株TD-PN85 在42 h 時(shí)達(dá)到最大細(xì)胞OD600值(30.24),其最大乙酸鈉利用速率為1.20 g·L-1·h-1(9～12 h),相比于野生型提高了12%,但平均乙酸鈉利用速率未見明顯提升。 TD-PN85 利用乙酸鈉時(shí)的PHB 產(chǎn)量為6.01 g·L-1,此時(shí)細(xì)胞干質(zhì)量為9.7 g·L-1,PHB 含量為62%。

20 g·L-1的葡萄糖和27.3 g·L-1的乙酸鈉含有相同的碳摩爾數(shù)(約0.667 mol·L-1)。 當(dāng)菌株TD1.0 以葡萄糖為底物時(shí),其合成PHB 的碳摩爾轉(zhuǎn)化率為42.7% C-mol;以乙酸鈉為底物時(shí)的PHB 碳摩爾轉(zhuǎn)化率為40.9% C-mol;工程菌TD-PN59 以乙酸鈉為底物時(shí)合成PHB 的碳摩爾轉(zhuǎn)化率為45.3%C-mol,相比于TD1.0 利用葡萄糖或乙酸鈉時(shí)分別提升了6.1%和10.8%。

上述結(jié)果表明,以廉價(jià)乙酸鹽替代葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)PHB 是可行的,并且通過過表達(dá)ACS,不僅可以提高TD1.0 的乙酸鈉利用速率,還可提高細(xì)胞干質(zhì)量和PHB 的產(chǎn)量。 葡萄糖需要經(jīng)過整個(gè)EMP 途徑代謝后才能轉(zhuǎn)化為PHB 的前體物乙酰輔酶A,而乙酸進(jìn)入細(xì)胞后僅需一步反應(yīng)就可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(圖2),因此以乙酸為碳源合成PHB 時(shí)在乙酰輔酶A 供應(yīng)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 除了過表達(dá)ACS 之外,在后續(xù)的工作中還可以通過激活乙醛酸循環(huán)[21]和實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化[22]等策略提進(jìn)一步提高乙酸鹽的利用效率。

2.3 葡萄糖與乙酸鈉混合碳源發(fā)酵

隨后考察了ACS 表達(dá)對(duì)菌株代謝葡萄糖和乙酸鈉混合碳源(60 MMG,10 g·L-1葡萄糖和10 g·L-1乙酸鈉)的影響,結(jié)果如圖6 所示。

圖6 混合碳源條件下菌株碳源消耗和生長(zhǎng)曲線Fig.6 OD600 and the consistence of Glu/NaAC

TD1.0 在代謝葡萄糖和乙酸鈉混合碳源時(shí)表現(xiàn)出明顯的代謝物阻遏效應(yīng)[23],即先利用葡萄糖后利用乙酸鈉的特征,由于生長(zhǎng)前期只快速利用葡萄糖而造成代謝溢流現(xiàn)象,生成了乙酸副產(chǎn)物而使得培養(yǎng)基中乙酸鈉含量略有上升(最高至10.52 g·L-1),待葡萄糖濃度較低(<4 g·L-1)時(shí),逐漸開始利用乙酸鈉,最終在28 h 時(shí)完全消耗完2 種碳源。 與野生型TD1.0 相比,過表達(dá)ACS 的菌株TD-PN85 在生長(zhǎng)前期葡萄糖利用較緩,但卻具有明顯的葡萄糖和乙酸鈉共利用的特征,且沒有發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中因利用葡萄糖而導(dǎo)致乙酸增加的現(xiàn)象,說明表達(dá)ACS 后導(dǎo)致乙酸利用效率提升而快速消耗掉葡萄糖產(chǎn)生的乙酸,最終在培養(yǎng)26 h 時(shí)能夠完全消耗完2 種碳源,最大細(xì)胞OD 為39.68,高于TD1.0(35.62)。 在整個(gè)發(fā)酵過程中,TD-PN85 菌株雙碳源共利用的最大速率為1.63 g·L-1·h-1(12 ～ 14 h),比TD1.0(1.08 g·L-1·h-1,6～8 h)提高了約51%。 同樣地,我們也進(jìn)行了TD-PN59 的混合碳源生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),但因?yàn)榭截悢?shù)過高,給菌株帶來了巨大的代謝負(fù)擔(dān),延緩了菌株生長(zhǎng),葡萄糖和乙酸利用速率均大幅降低。

由圖7 可知,菌株TD-PN85 的CDW 和PHB 產(chǎn)量均略高于對(duì)照菌株TD1.0。 在34 h 時(shí),對(duì)照菌株TD1.0 利用混糖取得最大CDW 為7.82 g·L-1,PHB產(chǎn)量為4.22 g·L-1,含量為54%。 菌株TD-PN85 同樣在34 h 時(shí)取得最大CDW 為7.91 g·L-1,PHB 產(chǎn)量為4.43 g·L-1,含量為56%,相比于對(duì)照菌株均稍有提升。 與單一碳源相比,2 個(gè)菌株在利用葡萄糖/乙酸鈉混合碳源時(shí)的PHB 碳摩爾轉(zhuǎn)化率均顯著下降(約為35% C-mol),這很可能是因?yàn)榈攘颗浔鹊钠咸烟呛鸵宜徕c造成了比較顯著的代謝模式轉(zhuǎn)換,從而影響到PHB 的合成效率,后續(xù)研究中需要進(jìn)一步優(yōu)化2 種碳源的比例或添加方式以提高PHB 的合成。

圖7 混合碳源條件下菌株CDW 和PHB 產(chǎn)量Fig.7 CDW and PHB from Glu/NaAC

實(shí)驗(yàn)表明,在嗜鹽菌TD1.0 中,采用質(zhì)粒pN85-M-ACS 過表達(dá)ACS 可以有效緩解葡萄糖代謝物阻遏效應(yīng),促進(jìn)葡萄糖和乙酸鈉的共利用,但PHB 產(chǎn)量并沒有得到顯著提高。

3 結(jié)論

1)嗜鹽單胞菌Halomonassp.TD1.0 可耐受高濃度乙酸鈉,乙酸鈉濃度從25 g·L-1提高至100 g·L-1時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)抑制程度只有45.8%,其乙酸鈉耐受性顯著優(yōu)于大腸桿菌等普通模式菌株,并可利用乙酸鈉為單一碳源高效合成PHB。

2)在嗜鹽單胞菌TD1.0 中表達(dá)異源乙酰輔酶A 合成酶后的工程菌TD-PN59 的乙酸鹽平均利用速度提高了19.7%,并且其細(xì)胞干質(zhì)量、PHB 產(chǎn)量和PHB 胞內(nèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到9.98 g·L-1,6.49 g·L-1和65%,分別比同樣培養(yǎng)條件下的野生型菌株提高了3.2%,10.8%,和 7.3%。

3)低拷貝量表達(dá)acs可以顯著緩解葡萄糖對(duì)乙酸鈉的分解代謝物阻遏效應(yīng)實(shí)現(xiàn)葡萄糖和乙酸鈉的共利用。