東方蠑螈脊髓損傷模型的建立及其評價

王 迪 趙 曼 陳 杰 湯 梟 李 君

(1.安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖第二人民醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury, SCI)是一種在醫(yī)學上至今仍然不能被治愈的疾病，脊髓損傷后會使機體自損傷節(jié)段以下的部位失去感覺和運動功能，給人類身心帶來極大的痛苦.因此，實現人類脊髓損傷的再生修復是再生醫(yī)學領域科學家的追求.而自然界中有一些生物的再生能力則令人嘆服，比如渦蟲[1]、斑馬魚[2]、壁虎[3]、蝌蚪[4]、蠑螈[5]等.

東方蠑螈(Cynopsorientalis)，也稱中國火龍，是兩棲動物有尾目蠑螈科的一種.它能在四肢[6]、尾部[7]、視網膜[8]、頜骨[9]、心臟[10]、脊髓[11]受損后實現再生，正是由于它的這種獨特的再生能力而成為發(fā)育生物學、再生生物學領域的良好模式生物.它能實現脊髓的軸突和神經元再生，重塑中樞神經系統，讓機體恢復感覺和運動功能.東方蠑螈脊髓損傷模型的成功構建將為SCI后軸突再生和神經再生研究提供一種有價值的動物模型，為我們了解東方蠑螈SCI再生的細胞和分子機制奠定基礎，進而為人類的SCI治療提供新思路.

如今，對SCI再生研究的動物模型構建鮮有全面的報道，很多不同的損傷模型都被用來研究脊髓再生，其中最主要的兩種模型是尾部截斷和脊髓橫斷[12].尾部截斷是單極損傷，脊髓將向尖端再生，其中包含了脊髓、骨骼肌、脊索、血管和皮膚的再生；而脊髓橫斷是雙極損傷，頭端和尾端都延伸到間隙并最終重新連接，主要是啟動神經束的再生[13].脊髓橫斷有兩個主要位置，分別位于胸椎節(jié)段和尾部節(jié)段.在胸椎節(jié)段會導致后肢癱瘓，可以模擬出人類遭受車禍或者疾病造成脊髓損傷的癥狀，且可根據其行為學表現判斷恢復情況.早期Piatt[14]就通過橫斷分別處于胚胎、幼體和成體這三種不同年齡階段東方蠑螈的主干脊髓，發(fā)現在發(fā)育的所有階段，脊髓在解剖學和功能上都能再生，而成體需要更長的時間才能再生.本文將圍繞10月齡幼體東方蠑螈進行脊髓胸部水平橫斷的方法進行探討，并對損傷后的動物進行運動評分，為SCI再生的研究提供重要的動物模型.

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

實驗所用東方蠑螈均購買自湖北武漢地區(qū)，飼養(yǎng)于22 ℃±3 ℃的玻璃水族箱中，水系統pH值保持在7.2～7.4，并給其提供水陸兩棲的生活環(huán)境，每天換水一次，投蟲干喂養(yǎng)，提供14 h白晝和10 h黑夜的光照周期，適應一周.挑選體重為1.5 g～2 g健康東方蠑螈，雌雄不限，隨機分成兩組，模型組20只，采用脊髓橫斷術進行脊髓損傷模型構建；假手術組20只，只進行椎板移除，不橫斷脊髓.各組分別于術后不同時間點進行行為學評分，直至實驗組恢復游泳能力.所有實驗均經安徽師范大學生命科學學院倫理與動物關愛與使用委員會批準.

1.2 脊髓損傷模型建立

將東方蠑螈放在質量分數為0.05%的三卡因溶液(pH=7.2～7.4)中，麻醉10 min～15 min，見動物不再游動且身體觸摸無反射時將動物取出，俯臥于解剖盤中，使它的軀干區(qū)域稍微支撐起來.在它的頭部和尾部上蓋上濕潤的海綿，用體積分數為75%酒精輕輕擦拭皮膚，用無菌的13號囊膜剪對東方蠑螈脊椎T7～T9棘突處(背側前后肢1/2位置)脊椎骨進行脊髓橫斷，建立脊髓損傷模型，肌肉和椎骨做一個橫向深切口，露出脊髓，橫斷脊髓，如圖1.用無菌PBS沖洗傷口的血液，再用手術鑷閉合傷口，在傷口滴加適量的醫(yī)用組織膠水，并在冰上靜置10 min左右.轉移到玻璃水族箱中恢復，恢復期間使用脫氯水.手術結束后約20 min即可醒來，待動物蘇醒后將其放在平面上爬行，以后肢完全沒有輔助力量、自然拖動前行作為建模成功的標準.假手術組作為對照，即在其他操作一致的前提下對脊髓只進行暴露，不進行橫斷.

圖1 東方蠑螈脊髓損傷模型的建立

1.3 術后護理

將兩組實驗動物分別放在飼養(yǎng)條件相同的兩個水族箱中，使用含有抗菌素的脫氯水飼養(yǎng)，前三天置于避光環(huán)境中恢復且不喂養(yǎng)食物，防止污染水質造成傷口感染.從第四天開始置于正常光照中且開始喂食物.

1.4 SCI模型組和對照組影像學檢測

脊髓損傷后即刻需要在低溫環(huán)境下迅速取出受損的脊髓組織，選擇的取材位置及尺寸為東方蠑螈背部損傷位點的上、下各4 mm，共8 mm左右，且包含椎骨，用體積分數為4%多聚甲醛固定液固定標本24 h以上，后用脫鈣液脫鈣40天，前三次每五天換一次脫鈣液，而后每日更換，脫鈣結束后使用梯度酒精組(體積分數分別為75%、85%、90%、95%、100%的酒精)進行脫水，后用二甲苯透明，石蠟包埋，最后使用厚度4 μm的石蠟切片，進行Hematoxylin-Eosin(蘇木精-伊紅)染色法染色，以正常東方蠑螈作為對照，在光學顯微鏡下觀察并拍照記錄.

1.5 運動功能評價

對模型組和假手術組的后肢運動情況進行評分，根據東方蠑螈在陸上爬行和水中游泳情況，對兩組動物手術前與術后不同時間點(2 d、4 d、7 d、14 d、21 d，用0 d表示手術后立即測試的結果)后肢的運動和游泳功能恢復情況進行評估.將東方蠑螈置于1 m×1 m的正方形水平濕潤礦場內，充分適應環(huán)境后，觀察其后肢反射、尾部反射、后肢爬行協調能力、腳掌著地情況、五分鐘內爬行距離.將東方蠑螈置于15 cm×30 cm的魚缸中，盛滿1/2的飼養(yǎng)用脫氯水，充分適應環(huán)境后觀察其后肢輔助游泳情況，三人同時對運動行為進行評分，評分標準見表1，匯總評分結果，求其平均值作圖分析.

表1 東方蠑螈后肢運動情況評分表

1.6 統計學分析

兩組實驗動物的運動功能評價結果用均數±標準誤差表示，用SPSS19.0軟件包進行統計學分析處理，組間比較采用t檢驗，組內兩兩比較采用SNK-q檢驗.以P<0.05表示差異具有統計學意義.

2 結果

2.1 術后動物一般情況觀察

術后短期內動物運動量明顯減少，喜陸棲，對一直在爬臺上的蠑螈要在每次換水時將其放入水中自由游動，否則會因在空氣中時間太長導致皮膚干涸而死.術后模型組出現明顯的雙后肢癱瘓，尾部無輔助力量，僅能靠前肢艱難活動，對照組則運動功能正常.所有蠑螈傷口恢復期間無出血，無感染，恢復良好，與預期相符.

2.2 建模成功影像學結果

從形態(tài)學染色可以看出，正常東方蠑螈的脊髓矢狀切片中，中央管周圍的室管膜細胞排列整齊，形態(tài)完整(如圖2A)，脊髓損傷手術處理后即刻的組織切片可見明顯切口(如圖2B)，脊髓腔中的細胞排列遭到嚴重破壞，脊髓前后斷連，表現為脊髓橫斷狀態(tài)，與行為學結果一致，表明建模成功.

圖2 東方蠑螈脊髓損傷建模對比圖

2.3 行為學評分結果

在0 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d對兩組動物的后肢運動、游泳、感覺和反射功能進行行為學評分，結果如表2和圖3所示.發(fā)現SCI模型組動物評分整體呈上升趨勢，對照組呈不變趨勢，在0 d、2 d、4 d、7 d、14 d時模型組和對照組有極顯著差異(P<0.001)，在21 d時相比有較顯著差異(P<0.01).此結果說明了模型組動物的后肢運動和感覺功能在恢復，東方蠑螈具有脊髓再生修復的能力，是研究脊髓損傷再生的良好動物模型.

表2 兩組動物在不同時間點運動功能評分的比較

圖3 東方蠑螈脊髓損傷后運動功能評分

2.4 模型組和對照組的影像學結果

根據行為學的結果，選擇脊髓損傷后4天和10天的時間點進行脊髓組織冠狀切片染色處理，觀察受損脊髓恢復的程度.根據蘇木精-伊紅染色結果可知(圖4)，SCI處理后4天仍可看到脊髓中細胞排列結構仍處于被破壞狀態(tài)，室管膜膠質細胞和神經細胞散亂，脊髓中出現細胞空洞，散落在脊髓腔周圍.但隨著蠑螈自主恢復的進行，脊髓損傷后10天細胞逐漸恢復規(guī)則排列，被破壞的組織結構也逐漸還原.室管膜細胞和神經細胞基本規(guī)則排列，對應行為學評分出現明顯好轉，但仍存在大量的細胞空洞，并未完全恢復.

圖4 脊髓損傷不同時刻的橫切HE染色結果圖

3 討論

從19世紀50年代，人們就開展了針對脊髓再生的研究，近些年來，很多具備脊髓再生能力的動物就成了再生生物學領域的模式生物，而關于動物模型的建立方法則鮮有報道.東方蠑螈具有在尾部截肢、脊髓半切、脊髓完全橫斷、脊髓擠壓損傷后再生脊髓的能力，且這種能力貫穿一生[15].Piatt曾對五個不同發(fā)育時期的蠑螈進行脊髓橫斷后175天的恢復情況觀察，發(fā)現均能實現完全再生，且年齡越小越快恢復[14].本文使用10月齡幼體東方蠑螈進行脊髓完全橫斷實驗，此方法的優(yōu)點在于：(1)再生速度快，有效縮短實驗周期；(2)實驗動物造價低，容易獲得；(3)實驗有很好的可重復性和可操作性，易于在相同的條件控制.該模型有一定的局限性，東方蠑螈體型小，應謹慎操作，且開口不可過大，否則容易感染致死，其次，東方蠑螈椎骨堅硬且厚實，脊髓細且脆弱，要細心操作.

Piatt的研究發(fā)現在幼體蠑螈中，脊髓損傷的頭端和尾端僅需7天即可發(fā)生解剖學上的重連，也有研究者通過組織學技術發(fā)現在脊髓再生期的第7天，室管膜發(fā)生部分連續(xù)，在橫斷區(qū)至少在脊髓一側可見軸索；在再生期第28天，室管膜上皮和管腔幾乎已正常連續(xù)，且軸索重建[12].這與本實驗行為學結果相符合.期待此動物模型能為東方蠑螈脊髓損傷再生的分子細胞機制研究提供基礎，找到哺乳動物無法再生的原因，進而為實現人類脊髓損傷的再生醫(yī)學實踐謀福音.