橄欖苦苷通過circMBOAT2/miR-106a-5p信號通路調控口腔鱗癌細胞CAL27增殖和凋亡的機制

李鋮 孫紅玲 顧超

(東南大學附屬中大醫院江北院區口腔科，江蘇 南京 210000)

口腔癌是全球第六大常見癌癥，2018年全球口腔癌新增病例高達35萬例[1]。口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔癌的主要亞型，臨床主要采用手術聯合放療治療策略，但由于侵襲性強、惡性程度高以及腫瘤耐藥，OSCC患者的預后仍不甚理想。中醫藥作為醫學的重要組成部分，對惡性腫瘤的治療越來越受到重視。橄欖苦苷是橄欖果實和橄欖葉的主要多酚成分，體外研究表明該化合物在結腸癌、肝癌、乳腺等多種癌癥中顯示出細胞毒性、促凋亡、抗增殖和抗轉移作用[2-3]。此外，橄欖苦苷還可抑制裸鼠卵巢癌、子宮頸癌移植瘤形成[4-5]。然而，橄欖苦苷在OSCC中的抗腫瘤作用尚未闡明。環狀RNA(circRNA)是由前體mRNA選擇性剪接形成的非編碼RNA，通常在多種組織和細胞中表達，并通過circRNA-miRNA信號軸參與OSCC細胞生物學行為，具有OSCC臨床生物標志物和治療靶點的巨大潛力[6]。研究表明前列腺癌中circRNA MBOAT2(circMBOAT2)高表達與高Gleason評分、晚期病理分期和預后不良相關，并增強前列腺癌細胞體外增殖、遷移和侵襲能力，促進體內腫瘤發生和轉移[7]。生物信息分析預測到miR-106a-5p是circMBOAT2的潛在靶點。OSCC中miR-106a-5p表達下調，miR-106a-5p通過抑制己糖激酶2(HK2)在OSCC中發揮抗腫瘤作用[8]。預實驗顯示橄欖苦苷處理能夠改變OSCC細胞circMBOAT2和miR-106a-5p水平。基于此，本研究以circMBOAT2/ miR-106a-5p通路為切入點，探討橄欖苦苷在OSCC中抗腫瘤作用，旨在為橄欖苦苷在臨床OSCC治療中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 收集2018年3月～2019年11月在我院行手術切除的31例OSCC患者的癌組織和匹配的鄰近正常癌旁組織。男性20例，女性11例，年齡35～72歲，中位年齡52歲。切除后立即將新鮮組織放入液氮中保存。納入本研究的患者均經病理診斷，術前未行放療、化療等治療。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.1.2 細胞和試劑 CAL27細胞購自美國ATCC；橄欖苦苷(純度大于95%，BP1028)購自成都普瑞法科技公司；Prime Script逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑購自大連Takara公司；Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司；靶向circMBOAT2的小干擾RNA(si-circMBOAT2)及其陰性對照(si-NC)、circMBOAT2過表達質粒(pcDNA-circMBOAT2)購自上海吉瑪制藥公司；細胞計數試劑盒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(ab9485)、剪切型半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)兔多抗(ab2302)、羊抗兔IgG二抗(ab205718)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自上海艾博抗公司；總RNA提取試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀測定(RIPA)試劑、雙熒光素酶報告試劑盒購自北京索萊寶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測并驗證circMBOAT2與口腔鱗癌的相關性 RT-qPCR檢測OSCC組織中circMBOAT2和miR-106a-5p表達，用總RNA提取試劑盒分離OSCC組織和癌旁組織的總RNA，測定總RNA純度和濃度合格后利用Prime Script逆轉錄試劑盒將1 μg總RNA合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑以cDNA為模板進行RT-qPCR。數據采用2-ΔΔCt法進行分析。circMBOAT2上游引物5′-GGAGTGGA GAACATGCACAA-3′，下游引物5′-AAGGCAAAG AGTTGGCACAC-3′；GAPDH上游引物5′-GGCCT CCAAGGAGTAAGACC-3′，下游引物5′-AGGGGA GATTCAGTGTGGTG-3′；miR-106a-5p上游引物5′-GATGCTCAAAAAGTGCTTACAGTGCA-3′，下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA AAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTG TCAT-3′。

1.2.2 CAL27細胞的培養和分組 CAL27細胞在DMEM中培養，該培養基中添加10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素。培養箱條件為37℃、二氧化碳體積分數為5%、飽和濕度。轉染前一天將對數期CAL27細胞1×104個/孔接種6孔板，用Lipofectamine 2000試劑將si-circMBOAT2、si-NC、pcDNA-circMBOAT2分別轉染50%融合的CAL27細胞。收集轉染48 h細胞按照“1.2.1”步驟檢測circMBOAT2表達水平。分別用含0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL橄欖苦苷[11]的培養液孵育CAL27細胞，記為橄欖苦苷0 μg/mL、橄欖苦苷200 μg/mL、橄欖苦苷400 μg/mL、橄欖苦苷800 μg/mL組；轉染si-circMBOAT2、si-NC的CAL27細胞分別記為si-circMBOAT2組、si-NC組；用含800 μg/mL橄欖苦苷的培養液孵育轉染pcDNA-circMBOAT2的CAL27細胞，記為橄欖苦苷800 μg/mL+pcDNA-circMBOAT2組。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉染48 h CAL27細胞，未轉染CAL27細胞均以2×103個/孔接種96孔板。按照“1.2.2”分組用對應濃度的橄欖苦苷孵育細胞48 h。棄去培養液，每孔加入10 μL CCK-8溶液和90 μL培養液。孵育2 h后，用酶標儀在450 nm處測定吸光度(A)。抑制率(%)=(1-實驗A/對照A)×100%

1.2.4 集落形成實驗檢測集落形成數 胰酶消化各組CAL27細胞，PBS洗滌兩次。以3×102個/孔將各組CAL27細胞接種6孔板，輕旋平板使細胞分散均勻。放入37℃培養箱孵育8～14 d，當看到細胞集落時終止培養，棄去細胞懸液。用5%多聚甲醛固定細胞集落，0.05%結晶紫染色。計數大于50個細胞的集落數。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 胰酶消化各組CAL27細胞，PBS洗滌兩次。用500 μL的1×結合緩沖液中重懸細胞沉淀，加入5 μL annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光染色15 min。流式細胞儀用于測定CAL27細胞凋亡率。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測Cleaved-caspase3蛋白表達 用RIPA試劑裂解轉染各組CAL27細胞，用BCA法測定濃度。取20 μg變性蛋白經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移到硝酸纖維素(NC)膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉NC膜后，用一抗(Cleaved-caspase3抗體1∶500稀釋，GAPDH抗體1∶3000稀釋)在4℃下孵育NC膜過夜。在室溫下用二抗(1∶2500稀釋)與NC膜反應2 h。使用ECL試劑盒測定蛋白條帶。用Quantity One軟件定量Cleaved-caspase3蛋白相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 將含有miR-106a-5p結合位點的circMBOAT2野生型(WT)序列或不含該結合位點的circMBOAT2突變(MUT)序列克隆到pGL3質粒，構建熒光素酶報告載體WT-circMBOAT2、MUT-circMBOAT2。將WT-circMBOAT2+miR-106a-5p、WT-circMBOAT2+miR-NC、MUT-circMBOAT2+miR-106a-5p、MUT-circMBOAT2+miR-NC分別轉染到CAL27細胞中。轉染48 h，用雙熒光素酶報告試劑盒測定熒光素酶活性。相對熒光素酶強度以螢火蟲與海腎熒光素酶活性的比值表示。

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測circMBOAT2和miR-106a-5p在OSCC中的表達 OSCC組織中circMBOAT2相對水平高于癌旁組織，miR-106a-5p相對水平低于癌旁組織(均P<0.05)，見圖1A、圖1B。OSCC組織中circMBOAT2和miR-106a-5p表達水平呈負相關，見圖1C。

圖1 circMBOAT2和miR-106a-5p表達及相關性分析(n=31)

2.2 橄欖苦苷對CAL27增殖、凋亡的影響 與橄欖苦苷0 μg/mL組比較，橄欖苦苷(200、400、800 μg/mL)組CAL27細胞集落形成數顯著減少(P<0.05)，增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高(P<0.05)。隨著橄欖苦苷濃度的增加，其對CAL27細胞增殖抑制和凋亡促進作用逐漸增強，見圖2、表1。

圖2 橄欖苦苷誘導CAL27凋亡及促進Cleaved-caspase3蛋白的表達

表1 橄欖苦苷抑制CAL27增殖誘導凋亡

2.3 橄欖苦苷對CAL27中circMBOAT2和miR-106a-5p表達的影響 與橄欖苦苷0 μg/mL組比較，橄欖苦苷(200、400、800 μg/mL)組CAL27細胞circMBOAT2相對水平顯著降低(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平顯著升高(P<0.05)。隨著橄欖苦苷濃度的增加，其對CAL27細胞circMBOAT2表達的抑制作用、對miR-106a-5p表達的促進作用逐漸增強，見圖3。

2.4 circMBOAT2靶向miR-106a-5p starbase預測到circMBOAT2和miR-106a-5p存在互補序列(圖4)。WT-circMBOAT2和miR-106a-5p共轉染組細胞相對熒光素酶強度低于WT-circMBOAT2和miR-NC共轉染組(P<0.05)；MUT-circMBOAT2和miR-106a-5p共轉染組細胞相對熒光素酶強度與MUT-circMBOAT2和miR-NC共轉染組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.5 沉默circMBOAT2對CAL27增殖、凋亡的影響 與si-NC組比較，si-circMBOAT2組CAL27細胞circMBOAT2相對水平、集落形成數顯著降低(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平、增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖5、表3。

圖3 橄欖苦苷抑制circMBOAT2及促進miR-106a-5p表達

圖4 circMBOAT2和miR-106a-5p互補序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

圖5 沉默circMBOAT2誘導CAL27凋亡及促進Cleaved-caspase3蛋白的表達

表3 沉默circMBOAT2抑制CAL27增殖誘導凋亡

2.6 過表達circMBOAT2對橄欖苦苷處理的CAL27增殖、凋亡的影響 與橄欖苦苷 0 μg/mL組比較，橄欖苦苷 800 μg/mL組CAL27細胞circMBOAT2相對水平、集落形成數顯著降低(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平、增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與橄欖苦苷 800 μg/mL組比較，橄欖苦苷800 μg/mL+pcDNA-circMBOAT2組CAL27細胞circMBOAT2相對水平、集落形成數顯著升高(P<0.05)，miR-106a-5p相對水平、增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見圖6、表4。

圖6 過表達circMBOAT2可減弱橄欖苦苷對CAL27凋亡的誘導作用及Cleaved-caspase3蛋白表達的促進作用

表4 過表達circMBOAT2可減弱橄欖苦苷對CAL27增殖凋亡的作用

3 討論

中藥的作用包括抑制腫瘤細胞生長、增強機體免疫力、減少癌癥復發和轉移，在惡性腫瘤治療方面具有獨特優勢[9]。橄欖苦苷是多酚類活性化合物，具有抗氧化、抑菌、抗炎、降壓和抗癌作用[10]。橄欖苦苷可通過誘導雌激素受體陽性乳腺癌細胞的自噬來抑制癌細胞遷移和侵襲[11]，通過抑制蛋白激酶B(AKT)信號通路進而抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲[12]，通過激活caspase途徑來誘導成神經細胞瘤細胞凋亡[13]。本研究發現橄欖苦苷以劑量依賴方式抑制OSCC細胞CAL27增殖和集落形成能力，激活Cleaved- caspase3并誘導細胞凋亡，表明橄欖苦苷在OSCC中具有抗腫瘤活性。circRNA和miRNA是腫瘤細胞生物學行為調控的關鍵因子，其表達失調與腫瘤啟動、進展息息相關[14]。研究發現橄欖苦苷可改變miRNA的表達發揮腫瘤活性，例如橄欖苦苷可下調肝癌中致癌因子miR-155-5p水平，上調抗癌因子miR-194-5p水平[15]。橄欖苦苷通過緩解缺氧誘導因子對miR-299表達的抑制作用，進而提高卵巢癌細胞的放射敏感性[16]。本研究中橄欖苦苷處理后CAL27細胞中circMBOAT2表達下調，miR-106a-5p表達上調，提示橄欖苦苷可能通過抑制circMBOAT2表達，促進miR-106a-5p表達，從而發揮抗腫瘤活性的作用。

已有研究證實circMBOAT2在結直腸癌組織和血清樣本中均高表達，是結直腸癌潛在診斷和獨立預后標志物，circMBOAT2通過靶向miR-519d-3p促進結直腸癌細胞增殖和轉移[17]。沉默circMBOAT2能夠抑制胰腺癌細胞增殖和谷氨酰胺分解代謝，促進細胞凋亡[18]。本研究發現OSCC組織中circMBOAT2表達上調，miR-106a-5p表達下調，且OSCC組織中circMBOAT2和miR-106a-5p水平呈負相關關系。現有報道關于miR-106a-5p在腫瘤進展中的作用并不一致，部分研究報道卵巢癌中miR-106a-5p表達增加并發揮促增殖、促轉移作用[19]。亦有研究顯示星形細胞瘤、腎細胞癌中miR-106a-5p表達下降，過表達miR-106a-5p可降低腫瘤細胞增殖和轉移能力[20-21]。本研究證實miR-106a-5p是circMBOAT2的直接靶點，其表達在CAL27細胞中受circMBOAT2負調控。功能分析顯示沉默circMBOAT2可抑制CAL27細胞增殖和集落形成能力，激活Cleaved-caspase3并誘導細胞凋亡，與橄欖苦苷對CAL27細胞抗癌效果類似。為證實橄欖苦苷的抗腫瘤作用與下調circMBOAT2有關，本研究將pcDNA- circMBOAT2轉染CAL27細胞，結果表明，過表達circMBOAT2部分逆轉了橄欖苦苷對CAL27細胞的增殖抑制作用以及對miR-106a-5p表達、細胞凋亡的促進作用，證實橄欖苦苷至少通過下調circMBOAT2/miR-106a-5p途徑抑制CAL27細胞增殖，誘導細胞凋亡。

4 結論

橄欖苦苷可抑制OSCC細胞CAL27增殖，誘導細胞凋亡，其機制是通過下調circMBOAT2/miR-106a-5p途徑實現的。這些發現表明橄欖苦苷具有防治OSCC進展的巨大潛力，circMBOAT2和miR-106a-5p可能是OSCC分子靶向治療的候選靶標。