牙膏中鼠李糖乳桿菌檢測方法的建立

鄭方媛 吳 淵 梁媛媛 夏琪琪 周志南 劉鵬鵬

(浙江方圓檢測集團股份有限公司，浙江省市場監管生物安全重點實驗室，浙江 杭州 310018)

近年來，口腔疾病已成為我國最為多發的常見病之一，涉及人群高達90%以上，菌群失調是引起口腔疾病的重要因素[1,2]。益生菌(Probiotics)對口腔健康的促進及調節作用已有諸多研究論證[3-7]，在牙膏中添加益生菌或其功效成分，可以有效改善口腔菌群失調。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)是應用最廣泛的益生菌之一，Elgamily等[8]實驗證明L.rhamnosus抗菌性和再礦化潛力優于多種生物活性多肽，推薦作為牙膏中的有效抗菌抑菌治療劑。

由于缺乏有效的牙膏中益生菌鑒定技術手段及監管措施，益生菌牙膏市場存在產品質量參差不齊的狀況，市售益生菌牙膏存在如益生菌標識與實際使用菌株不一致等現象。在中國益生菌行業中，除了根據《食品安全國家標準—食品微生物學檢驗—乳酸菌檢驗(GB4789.35-2016)》進行活菌數的測定和《食品用益生菌通則》團體標準外，并無其他相關標準用于益生菌產品的生產和經營。而傳統表型鑒定方法在菌種檢測對象上受限，操作復雜，耗時長，迫切需要建立快速、可靠的牙膏益生菌種類鑒定方法。

聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)廣泛應用于醫學和食品安全等領域病菌檢測[9,10]。相對于傳統表型鑒定方法，穩定性好、特異性好、靈敏度高。為適應市場益生菌牙膏檢測技術開發需求，本研究基于PCR檢測技術，以添加了L.rhamnosus的牙膏為研究對象，以德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)等4種菌種為對照，以促旋酶基因gyrB為靶標建立益生菌牙膏中L.rhamnosus成分的檢測技術并對其靈敏度和含量進行檢測和評價，旨在為益生菌牙膏產品的質量控制提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌株

實驗用參考菌株：3株乳桿菌屬參考菌株(鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus，菌株編號：CICC6224、德氏乳桿菌L.delbrueckii，菌株編號：CICC6077、萊士曼氏乳桿菌Lactobacillus.leichmannii，菌株編號：ATCC7830)，2株非乳桿菌屬參考菌株(蠟樣芽孢桿菌Bacillus.cereus，菌株編號：CICC23828、動物雙歧桿菌Bifidobacterium，菌株編號：ATCC7830)由中國工業微生物保藏管理中心提供。

乳桿菌屬以及動物雙歧桿菌采用MRS瓊脂[11]平板劃線，厭氧培養，分離與純化；蠟樣芽孢桿菌采用營養瓊脂[12]平板劃線、分離與純化。

1.1.2 試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物(純化方法：PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis)、DL 2000DNA marker、瓊脂糖(Agarose Regular)、10×TBE緩沖溶液(Tris-EDTA)、1000×D-HelixRed核酸染料和雙蒸餾水(ddH2O)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；2×PCR TaqMix 購自北京美萊博醫學科技有限公司；MRS瓊脂和普通瓊脂平板培養基購自北京陸橋生物技術有限責任公司。

1.2 主要儀器與設備

Microfuge 16臺式微量離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；Nano-300超微量分光光度計，杭州奧盛儀器有限公司；D1200板式加熱器，美國Labnet’s公司；ABI Veriti 梯度PCR儀，美國應用生物系統公司；Powerpac HC 1645052伯樂高流核酸電泳儀，美國Bio-Rad公司；Gel-Doc-XR+凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

牙膏樣品A(L.rhamnosus濃度：0.01%)、B(濃度：0.03%)、C(濃度：0.05%)、D(濃度：0.10%)，各取1.0g加入10g無菌水于離心管中充分混勻，制成濃度10%的牙膏水溶液，取1.0mL牙膏水溶液加至1.5mL離心管中，10000rpm離心2min棄上清，收集沉淀，標記-20℃保存備用。

1.3.2 DNA提取

參照細菌基因組DNA提取試劑盒使用手冊提取A、B、C、D牙膏樣品菌種DNA。乳桿菌屬以及動物雙歧桿菌接種于MRS瓊脂，37℃厭氧培養16～24h，蠟樣芽孢桿菌接種于營養瓊脂，37℃培養16～24h，用50 μL ddH2O收集培養物，置于95℃板式加熱器內裂解10min作為陽性和對照菌種DNA樣本。提取的DNA用超微量分光光度計檢測，并將其濃度調整為約20 ng·μL-1，-20℃保存備用。

1.3.3 PCR擴增體系及程序

參考楊小紅等[13]所用的L.rhamnosus特異性PCR引物組(rhaF，rhaR)，經國家生物技術信息中心(NCBI)進行同源性比對驗證，該區段基因為L.rhamnosus促旋酶基因gyrB的一段序列，具有特異性。利用細菌通用編碼16S rRNA相對應的染色體基因16sr DNA引物序列組對提取的牙膏中添加的L.rhamnosus有效成分進行擴增測序。

以提取的牙膏中菌種DNA和參考菌株的基因組DNA為模板，利用rhaF，rhaR引物組進行PCR擴增。20 μL PCR體系見表1，使用梯度PCR儀擴增，程序設置為：95℃ 5min，30個循環(95℃ 15s，57℃ 30s，72℃ 30s)，72℃ 10min，4℃保存。

核酸電泳檢測方法為在1%瓊脂糖凝膠上以120 V的電壓對7.0μL擴增產物進行30min電泳，在凝膠成像系統上觀察并拍照記錄擴增結果。

表1 PCR反應體系

1.3.4 PCR反應特異性測試

用rhaF，rhaR引物組分別對菌株L.rhamnosus，CICC6224、 L.delbrueckii，CICC6077、L.leichmannii， ATCC783、B.cereus，CICC23828、Bifidobacterium，ATCC7830進行擴增，以等體積ddH2O為模板空白對照，以不含以上菌株的DNA作為陰性對照。所有DNA均使用ddH2O稀釋至1 ng·μL-1作為模板，反應結束后分別取7.0μL擴增產物利用核酸電泳進行檢測。

1.3.5 對含不同濃度鼠李糖乳桿菌牙膏的PCR測試及測序

用rhaF，rhaR引物組分別對A(濃度：0.01%)、B(濃度：0.03%)、C(濃度：0.05%)、D(濃度：0.10%)4個牙膏提取的DNA(0.10 ng/μL)進行PCR擴增，以等體積L.rhamnosus，CICC6224陽性菌株的DNA為陽性對照，ddH2O為模板空白對照，以不含鼠李糖乳桿菌的DNA作為陰性對照。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

用細菌16S rDNA通用引物組(27F，1492R[14])對L.rhamnosus，CICC6224進行PCR擴增，并對其PCR產物經純化后測序，所測16S rDNA序列與GenBank數據庫中的L.rhamnosus序列進行BLAST比較。反應體系(25μL)：2×Taq PCR MasterMix 10μL，引物16SrDNA F和16SrDNA R(100 μmol·L-1)各0.5 μL，模板DNA 2.0μL，加ddH2O補足。擴增程序：95℃ 5min，30個循環(95℃ 15s，57℃ 30s，72℃ 130s)，72℃ 10min，4℃保存。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序。

1.3.6 PCR反應靈敏度測試

將L.rhamnosus濃度為0.05%的牙膏提取的DNA(20ng·μL-1)進行梯度稀釋至DNA濃度為：1ng·μL-1、0.5ng·μL-1、0.1ng·μL-1、0.05ng·μL-1、0.01ng·μL-1，用rhaF，rhaR引物組分別對這5個濃度梯度DNA進行PCR擴增，以等體積L.rhamnosus，CICC6224陽性菌株的DNA為陽性對照，ddH2O為模板空白對照，以不含L.rhamnosus的DNA作為陰性對照。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 PCR反應特異性測試結果

使用rhaF，rhaR引物組分別對5種菌株進行PCR擴增實驗，電泳結果見圖1。以ddH2O為模板的空白對照以及陰性對照無擴增產物，說明反應系統自身不發生擴增；以L.rhamnosus DNA為模板的反應產物在電泳圖上顯示核酸條帶，條帶長度與理論長度376bp相符，以L.delbrueckii、L.leichmannii、B.cereus、Bifidobacterium DNA為模板的擴增結果中無PCR特征條帶。說明以L.rhamnosus gyrB基因設計的特異性引物系統對L.rhamnosus DNA檢測具有良好的特異性。

2.2 對含不同濃度鼠李糖乳桿菌牙膏的PCR試驗及測序結果

將含0.01%、0.03%、0.05%、0.10%四個濃度的L.rhamnosus牙膏提取的DNA(0.10ng·μL-1)用作PCR反應的模板。電泳圖顯示條帶的亮度隨著L.rhamnosus濃度的增大而增強，且條帶長度與理論長度376 bp相符，空白及陰性對照均無條帶，陽性對照組顯示陽性(圖2)，說明擴增有效，并且通過PCR反應可以檢測到牙膏樣品中的L.rhamnosus，且根據條帶亮度可以判斷濃度范圍。

注：0：ddH2O模板；N：陰性對照；1-5表示各種菌的DNA模板1：鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus，2：蠟樣芽孢桿菌B.cereus，3：德氏乳桿菌L.delbrueckii，4：萊士曼氏乳桿菌L.leichmannii，5：動物雙歧桿菌Bifidobacterium。

注：0：ddH2O模板；N：陰性對照；P：陽性對照；1-4：不同濃度鼠李糖乳桿菌的牙膏提取DNA 1：0.01%，2：0.03%，3：0.05%，4：0.10%。

將含有L.rhamnosus濃度為0.10%的牙膏C提取的DNA進行16S rDNA擴增，測序后與GenBank數據庫中的L.rhamnosus 序列進行比較，結果均顯示與L.rhamnosus的序列一致性最高，說明牙膏中所添加的為L.rhamnosus的有效成分，含有L.rhamnosus DNA，并且建立的L.rhamnosus PCR體系能實現對牙膏中L.rhamnosus成分的有效檢測。

2.3 PCR反應靈敏度測試結果

將含L.rhamnosus牙膏提取的DNA濃度稀釋為1ng·μL-1、0.5ng·μL-1、0.1ng·μ-11、0.05ng·μ-11、0.01ng·μ-11，并用作PCR反應的模板。電泳圖在DNA濃度大于0.1ng·μ-11時顯示陽性結果(圖3)。在小于0.1ng·μ-11濃度下陽性較弱，結果判讀不可靠。因此對檢測牙膏中L.rhamnosus成分的PCR擴增方法靈敏度為0.1ng·μ-11。

注：0：ddH2O模板；N：陰性對照；P：陽性對照；1-5：DNA濃度 1：1ng·μ-11，2：0.5ng·μ-11，3：0.1ng·μ-11，4：0.05ng·μ-11，5：0.01ng·μ-11。

3 結論

益生菌牙膏產品的菌種組成與含量是產品質量的關鍵，基于L.rhamnosus gyrB基因的PCR方法對L.rhamnosus菌株檢測具有良好的特異性，且能實現牙膏中L.rhamnosus菌株的精確鑒定，該方法靈敏度為0.1ng·μ-11，該檢測限和靈敏度可基本滿足需求。構建適合益生菌產業應用的快速、精準的菌株檢測技術已成為益生菌行業的重要研究方向，本研究為建立和完善牙膏益生菌產品的質量控制提供技術參考，有助于提升產品評價、質量控制及市場監管水平。

由于試驗樣品的限制，為適應更廣的益生菌產品市場檢測應用領域，該方法設計的益生菌牙膏產品的菌種特異性擴增體系結合電泳的檢測方法對除本試驗中的L.rhamnosus外的其他益生菌菌株(如副干酪乳桿菌、雙岐桿菌等)的特異性擴增試驗有待進一步研究與填充，且益生菌牙膏產品中菌株有效成分的微量/痕量的檢測還需進一步穩定性研究。