基于微衛星標記的甌江唇魚骨增殖放流效果評估

郭愛環 原居林 練青平 曹容瑋，2 陳光美

(1 浙江省淡水水產研究所，農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江湖州 313001；2 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 3 浙江豐和漁業有限責任公司，浙江麗水 323000)

唇魚骨(Hemibarbuslabeo)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、魚骨屬(Hemibarbus)，廣泛分布于我國閩江、錢塘江、長江、黃河、黑龍江等各大水系，是1種重要的淡水經濟魚類[1]。唇魚骨主要以水生無脊椎動物及軟體動物為食，營底棲生活，生長迅速，通常在2齡左右達性成熟，繁殖期集中在每年4—5月[2-3]。

甌江是浙江省內的第二大河流[4]，位于浙江省東南部，屬典型的山溪性河流，溪流性魚類資源豐富[5]。近年來，由于過度捕撈、水域污染及水利工程建設等原因，甌江魚類野生資源日益衰退[6]，因此，開展人工增殖放流成為恢復甌江魚類野生資源最有效的方法之一。近年來，作為甌江土著魚類品種之一的唇魚骨被大量放流，據統計，2020年浙江省唇魚骨的增殖放流數量為9 440萬尾(從全國水生生物資源養護信息采集系統統計獲取)。在如此大規模增殖放流的態勢下，亟須開展唇魚骨增殖放流效果評估，為今后的增殖放流策略、實施和適應性管理提供重要參考依據。

內陸漁業增殖放流效果評估普遍采用剪鰭標記、鱗片耳石標志、體內外物理標記和化學熒光物質浸泡標記等方法[7]。與這些標記方法相比，微衛星DNA標記具有減少魚體損傷、標記不易丟失、標記檢測過程完全不受魚類生長和活動影響等優勢。此外，微衛星DNA標記具有數量大的特點，不但可以檢測個體，還適合群體的大規模標記[8-9]，因此已成為準確和長期評估增殖放流效果最有效的手段[10-11]。目前已有很多基于微衛星標記進行內陸水域增殖放流效果評估的研究報道，如成為為等[12]通過微衛星標記的方法對長江上游胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)增殖放流的效果進行了評估，推算出增殖放流的胭脂魚對長江中上游野生群體的貢獻率為16.92%。除此之外，通過對“四大家魚”中的鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)開展基于微衛星和線粒體DNA分子標記的增殖放流效果評估，結果說明，連續的增殖放流活動對漁業資源量的恢復具有累加效果[13-14]。

目前，有關唇魚骨的研究主要集中在人工繁殖[15]、養殖技術[16]、生理生化[3]、微衛星引物開發[17-19]、線粒體基因組解析[20]等方面，將唇魚骨微衛星標記應用于其增殖放流效果評估的研究報道較少。鑒于此，本研究以甌江唇魚骨回捕群體和放流子代的親本為研究對象，利用篩選出的高度多態性微衛星引物，通過親本與回捕個體的遺傳信息比對，識別回捕群體中的放流個體，對甌江唇魚骨增殖放流效果進行評估，以期為甌江唇魚骨的增殖放流提供指導和建議。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2017年5月，在浙江省麗水市蓮都區金滿水產苗種場選取28尾唇魚骨繁殖親本，共14個分組，其中分組1由1尾雌性個體(HL-1F)和1尾雄性個體(HL-1M)配對組成。將每個分組分別放在不同孵化池中進行子代繁殖，然后將繁殖的子代轉移至池塘內單獨飼養。2017年12月，將繁殖的唇魚骨子代進行放流，放流數量為5萬尾，放流點為甌江的大港頭水域，具體放流點情況見表1。剪取唇魚骨繁殖親本的鰭條，置于4 ℃冰箱內用無水乙醇保存備用。2018年8月開始在放流區域進行放流回捕，3個采樣點分別位于大港頭、碧湖和南明湖(見表1)，合計回捕唇魚骨103尾。測量回捕唇魚骨的體長、體質量等形態學參數(見表2)，并剪取鰭條，于4 ℃冰箱中用無水乙醇保存備用。

表1 唇魚骨放流點和采樣點情況

表2 唇魚骨子代采樣信息

1.2 基因組DNA提取及PCR擴增和測序

選用10對唇魚骨的微衛星引物[19,21](見表3)，分別在F正向引物末端標記上2種常用的熒光引物(5-HEX和5-FAM)[由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。PCR擴增反應體系為：25 μLTaqMasterMix(康為世紀生物科技有限公司)，2 μL上、下游引物稀釋液，1 μL DNA稀釋液，20 μL去離子水。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，在各自引物的退火溫度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃再延伸10 min。4 ℃保存PCR產物，然后經1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，用ABI 3730測序儀測取等位基因值，利用軟件GeneMarker V1.5讀取等位基因大小值[由生工生物工程(上海)股份有限公司測序]。

1.3 數據分析

使用Cervus 3.0[22]軟件統計各微衛星位點的等位基因數(Na)、雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態信息含量(PIC)和非親權排除率(NEP)。本研究用Cervus 3.0提供的最大似然法(ML)來分析親子關系，設置95%和80%兩個顯著水平，設定模擬參數如下：位點應用比例為1.0；潛在基因型錯誤率為1%，模擬運行100 000次。利用Genepop 4.0.10軟件檢驗微衛星位點是否符合Hardy-Weinberg平衡。

表3 10對唇魚骨的微衛星熒光引物參數

2 結果

2.1 微衛星標記多態性

本研究使用的10個微衛星位點均能在唇魚骨家系樣本和子代中獲得穩定的PCR擴增產物(見圖1)。結果顯示：10個位點在唇魚骨樣品中共檢測出等位基因數133個，平均每個位點等位基因數為13.3個，單個位點等位基因數(Na)為7～19個；多態信息含量(PIC)為0.501～0.883，平均多態信息含量為0.703，均表現出高度多態性；期望雜合度(He)為0.523～0.897，平均期望雜合度為0.737；觀測雜合度(Ho)為0.328～0.787，平均觀測雜合度為0.598。另外，除了座位Hma046、HL41和HL44未偏離Hardy-Weinberg平衡，其他座位均偏離了Hardy-Weinberg平衡。唇魚骨微衛星標記的多態性參數詳見表4。

圖1 唇魚骨部分微衛星位點基因分型結果

表4 唇魚骨微衛星標記的多態性參數

2.2 親子關系鑒定結果分析

Cervus 3.0軟件結果表明，在父母雙親未知的情況下，非親排除率(NEP)的范圍為0.043～0.400；累計非親排除率(CEP)在第3個座位時達到0.99以上，在第10個座位時達到0.999 999 62(見表5)。

表5 唇魚骨親子鑒定非親排除率和累計非親排除率

在95%置信度和LOD值(似然率的自然對數值)大于0的條件下，在較高的座位累計非親排除率回捕103尾樣本，其中3尾回捕唇魚骨個體經確認為本次放流的子代，因此，增殖放流對唇魚骨自然資源的貢獻率為2.91%。唇魚骨親子鑒定結果見表6。依據樣本編號，被鑒定出來的3尾唇魚骨中，1尾來自碧湖采樣點，其余2尾來自大港頭采樣點。

表6 唇魚骨親子鑒定結果

3 討論

3.1 微衛星座位多態性及親子鑒定分析

親子鑒定的準確率主要取決于微衛星位點的多態性[23]，而等位基因數(Na)、期望雜合度(He)和多態信息含量(PIC)是衡量微衛星位點多態性的重要指標。一般認為，微衛星位點的等位基因數、期望雜合度和多態信息含量越高，微衛星位點的多態性就越高。Botstein等[24]認為，微衛星標記He>0.6和PIC>0.5是最可信的辨別。本研究結果表明，10個微衛星位點的多態信息含量(PIC)為0.501～0.883，平均多態信息含量為0.703，均表現為高度多態性；期望雜合度(He)為0.523～0.897，平均期望雜合度為0.737；觀測雜合度(Ho)為0.328～0.787，平均觀測雜合度為0.598，因此，用于本研究的10對微衛星標記均具有較高的多態性。Hardy-Weinberg平衡是指在理想狀態下，各等位基因的頻率和等位基因的基因型頻率在遺傳中是穩定不變的，即保持著基因平衡。一般沒有選擇、突變、遺傳漂變以及隨機交配的自然種群的遺傳數據都符合Hardy-Weinberg平衡。本研究10個檢測位點中，只有3個座位符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，推測原因可能與樣本數量有關，群體樣本量較少會導致檢測結果偏離Hardy-Weinberg平衡，或者SSR引物擴增可能出現無效等位基因。另外，累計排除率也是影響親子鑒定的重要標準，如各位點排除率、位點數量和樣品總數等均會影響累計排除率。研究表明，位點的等位基因越多，其排除率越高；使用的位點數越多，總排除率越高；樣本數越多，總排除率越高[25]，累計排除率的最低標準一般為達到95%[26]。楊習文等[27]在對長江江蘇段的鰱進行親子鑒定時，所使用11個微衛星位點的累計排除率達99.99%以上；成為為等[12]在對長江胭脂魚進行增殖放流評估時選用了11個微衛星位點，累計排除率為99.998 3%；李小芳[14]在對鰱進行增殖放流評估時，選用了14個微衛星位點，累計排除率為99.91%。當雙親未知，累計排除率大于99%時，親子鑒定的結果基本可信。本研究選用了10個微衛星位點，當雙親未知時，累計排除率大于99.99%，因此，本研究選用的10個微衛星位點已含有足夠的遺傳信息用于親子關系分析，由此得到的親子鑒定結果可信度較高。

3.2 增殖放流效果評估

開展增殖放流效果評估，根據結果對其資源修復作用進行監測，可以為下一步增殖放流工作的開展提供基礎數據。目前，運用分子標記技術開展增殖放流效果評估已成為準確和長期評估增殖放流效果最有效的手段之一。本研究運用此方法評估出唇魚骨放流子代對野生群體的貢獻率為2.91%，說明在甌江的唇魚骨群體中存在一定數量的放流個體，同時增殖放流對唇魚骨的資源量補充起到了一定的作用。本研究增殖放流的回捕率低于已有研究中的大部分魚類，如長江鰱的增殖放流貢獻率為8.21%[27]，胭脂魚的貢獻率為16.92%[12]，而張敏瑩等[28]在錢塘江開展的三角魴增殖放流效果評估結果發現，三角魴增殖放流的資源貢獻率僅為1.08%。筆者推測，放流群體數量少是本研究回捕魚類個體數較少的主要原因之一；另一個原因是水域面積太大，魚類分布范圍廣，放流群體樣本被回捕的概率較小。此外，與很多研究報道中的幾百尾甚至上千尾的回捕樣本數量相比，本研究回捕樣本數量略顯不足。但是，本研究在選取回捕采樣點時，在位于兩座水電站中間的水域分別選取大港頭(近放流點)、碧湖(中游段)和南明湖(下游段)3個采樣點，兼顧放流魚類空間分布的同時，回收子代2年，也考慮了時間上的變化，在一定程度上彌補了回捕樣品數量偏少所造成的不足，降低了回捕樣品數量少對評估增殖放流貢獻率的影響。

目前，增殖放流效果評估的側重點多為對漁業資源量恢復的效果評估，而關于增殖放流人工群體對野生群體遺傳多樣性影響的評估有待于進一步加強。研究表明，增殖放流存在一定的遺傳風險，如增加群體基因流和遺傳同質性，降低有效群體大小等[29-30]。Liu等[29]對在盤錦大量增殖放流的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)進行了遺傳風險評估，結果顯示，大規模的增殖放流對盤錦本地種群及遼東半島水域種群產生了較大的遺傳風險。因此，在后續的研究中，建議在充分利用微衛星基因型數據的基礎上，加強對放流群體和野生群體的長期持續跟蹤，為唇魚骨增殖放流的科學評估和種質資源保護提供基礎數據。

4 小結

本研究利用10對微衛星標記對唇魚骨增殖放流效果進行評估，其累計親權排除率為0.999 999 62，推算出增殖放流的唇魚骨對甌江野生群體的貢獻率為2.91%。研究結果表明，甌江增殖放流的唇魚骨具有一定的資源恢復效果。此結果對其資源保護和后續開展科學增殖放流具有重要指導意義。