益母草堿調控LINC00461抑制宮頸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡的實驗研究

羅 娜，楊 啟（.南陽市中心醫院西藥科，河南 南陽 473000；.南陽市中心醫院肝臟普外科，河南 南陽 473000）

益母草是益母草干燥全草，具有活血調經、利水消腫、清熱解毒之功效，臨床常用于治療月經不調、痛經閉經等。益母草堿是益母草中的生物堿，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和保護神經等作用[1-2]。研究發現，益母草堿對肺癌細胞具有增殖抑制和凋亡誘導的作用[3]，從而發揮抗腫瘤作用，但關于益母草堿對宮頸癌的抗腫瘤作用尚不明確。LINC00461是近年發現的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在膠質瘤、肝細胞癌等組織中LINC00461表達上調，通過調控不同通路或miRNA參與癌細胞的增殖、凋亡和轉移等過程，發揮致癌基因作用，這表明LINC0046有望成為腫瘤的潛在標志物[4-5]。本研究通過相關預實驗發現，LINC00461在宮頸癌細胞中高表達，但具體作用機制尚不清楚。鑒于此，本研究以宮頸癌細胞株SiHa作為研究對象，探究益母草堿能否通過調控LINC00461影響宮頸癌細胞增殖、凋亡，以期為日后相關研究提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人宮頸癌細胞株SiHa購自美國模式菌種收集中心；鹽酸益母草堿購自南京迪兆生物科技有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、RNA提取試劑Trizol、Real-time PCR試劑盒、反轉錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；LINC00461過表達載體（pcDNA3.1-LINC00461）和陰性對照pcDNA3.1載體購自上海吉瑪制藥有限公司；p21抗體、Caspase-3抗體和GAPDH抗體購自美國Santa cruz公司；Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國BD公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與藥物處理 將SiHa細胞培養于含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。觀察細胞生長狀態，細胞培養至對數生長期，消化傳代。將細胞培養至貼壁后，在培養液中加入終濃度為10、20、30 μg·mL-1的益母草堿，分別記為益母草A、B、C組，未經過益母草堿處理的細胞作為對照組，繼續培養72 h，收集細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染 將處于對數生長期的SiHa細胞，以1 ～ 2×l05個·孔-1細胞接種于6孔板，當融合度為80%～ 90%時，分別將pcDNA3.1-LINC00461和pcDNA3.1轉染SiHa細胞，對應設為pcDNA3.1-LINC00461組和pcDNA3.1組。pcDNA3.1-LINC00461和pcDNA3.1轉染SiHa細胞后，加入30 μg·mL-1益母草堿，記為益母草C + pcDNA3.1組、益母草C + pcDNA3.1-LINC00461組，轉染48 h后，收集細胞進行實驗或藥物處理。

1.2.3 Real-time PCR檢測LINC00461相對表達量 收集各組SiHa細胞，采用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，按照Real-time PCR的說明書進行反應合成LINC00461和mRNA。LINC00461上游引物：5'-GACATTTACGCCACAACCCACG-3'，下游引物：5'-AGACAGACCCTCAGATTCCCCA-3'；GAPDH上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCA-3'，下游引物：5'-TGATGGCATGGACTGTGGTC-3'。運用2?ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.4 CCK8實驗檢測細胞存活率 收集轉染、益母草堿處理72 h后的SiHa細胞，以2×103個·孔-1（100 μL細胞）接種于96孔板中，加10 μL CCK8溶液，培養2 h，酶標儀測定450 nm吸光度（A）值。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.5 克隆形成實驗 將藥物處理或轉染后的SiHa細胞以每皿約100個接種于細胞培養皿中，加入10 mL培養液混勻，培養至出現肉眼清晰可見的細胞克隆（約10 ～ 14 d），棄培養液，洗滌細胞2次，甲醛固定細胞，結晶紫染色，計數。

1.2.6 流式細胞術測定細胞凋亡率 將SiHa細胞以2×105個·孔-1接種于6孔板，培養24 h，用益母草堿處理72 h，消化收集細胞，按照凋亡試劑盒說明書進行操作，加入5 μL膜聯蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶，避光20 min，使用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.7 Western blot實驗 將轉染的、益母草堿處理的各組SiHa細胞進行裂解收集蛋白。將蛋白樣本進行SDS-PAGE，轉膜，封閉1 h，加一抗（p21 1∶1000稀釋，Caspase-3 1∶1000稀釋），4 ℃孵育過夜，加稀釋的二抗，室溫孵育1 h。以GAPDH為內參照，分析蛋白水平。

1.3 統計學處理

數據采用SPSS 19.0軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。P < 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度益母草堿對SiHa細胞增殖和凋亡的影響

與對照組相比，益母草堿A、B、C組細胞存活率、克隆形成數均降低，細胞凋亡率升高，p21和Caspase-3蛋白表達量均升高，且具有劑量依賴趨勢（P < 0.05），見表1。根據結果，后期實驗選用存活率約為50%的益母草堿濃度（30 μg·mL-1）。

表1 不同濃度益母草堿對SiHa細胞增殖和凋亡的影響. n = 9Tab 1 Effect of different concentration of leonurine on proliferation and apoptosis of SiHa cells. n = 9

2.2 益母草堿對SiHa細胞中LINC00461相對表達量的影響

對照組SiHa細胞中LINC00461的相對表達量為（1.00±0.05），益母草C組SiHa細胞中LINC00461的相對表達量為（0.35±0.03），與對照組相比，益母草C組SiHa細胞中LINC00461的相對表達量降低（t =33.442，P < 0.05）。

2.3 過表達LINC00461對SiHa細胞增殖和凋亡的影響

結果顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-LINC00461組LINC00461相對表達量升高，p21和Caspase-3蛋白表達降低，凋亡率下降，細胞存活率和克隆形成數升高（P < 0.05），見表2。

表2 過表達LINC00461對SiHa細胞增殖和凋亡的影響. n = 9Tab 2 Effect of over-expression of LINC00461 on proliferation and apoptosis of SiHa cells. n = 9

2.4 過表達LINC00461對益母草堿作用的SiHa細胞增殖的影響

結果顯示，與對照組相比，益母草C組p21蛋白表達量升高，存活率和克隆形成數均降低（P <0.05）；與益母草C + pcDNA3.1組相比，益母草C +pcDNA3.1-LINC00461組p21蛋白表達量降低，存活率和克隆形成數均升高（P < 0.05），見表3。

表3 過表達LINC00461對益母草堿作用的SiHa細胞增殖的影響. n = 9Tab 3 Effect of over-expression of LINC00461 on proliferation of SiHa cells treated with leonurine. n = 9

2.5 過表達LINC00461對益母草堿作用的SiHa細胞凋亡的影響

結果顯示，與對照組相比，益母草C組Caspase-3蛋白表達量和細胞凋亡率均升高（P < 0.05）；與益母草C + pcDNA3.1組相比，益母草C + pcDNA3.1-LINC00461組中Caspase3蛋白表達量和細胞凋亡率均降低（P < 0.05），見表4。

表4 過表達LINC00461對益母草堿作用的SiHa細胞凋亡的影響. n = 9Tab 4 Effect of over-expression of LINC00461 on the apoptosis of SiHa cells treated with leonurine. n = 9

3 討論

益母草中包含生物堿、酚酸、二萜和黃酮類化合物，具有抗氧化、抗癌、保護神經、心臟和子宮的作用[6]。益母草根提取物能促進膠質瘤細胞凋亡[7]。益母草乙醇提取物以劑量和時間依賴方式誘導乳腺癌細胞凋亡[8]。益母草提取物可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，益母草沖劑可增強Ⅲ～Ⅳ期宮頸癌單純放療患者的療效[9-10]。益母草堿是從益母草中提取的生物堿，本研究旨在評價益母草堿對宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響。本研究結果顯示，不同濃度的益母草堿對SiHa細胞的存活、克隆形成均具有抑制作用，對細胞凋亡有促進作用，且呈劑量依賴性。Caspase-3是細胞凋亡發生的執行因子，研究表明Caspase-3表達與宮頸癌癌灶體積呈負相關，提高Caspase-3表達能夠縮小癌灶體積[11]。p21通過抑制細胞周期蛋白激酶復合物的活性，抑制DNA復制和修復，阻礙細胞周期轉換，具有抑癌作用[12]。本研究顯示，益母草堿呈劑量依賴關系提高p21和Caspase-3表達，與功能實驗結果吻合。以上結果表明，益母草堿能抑制宮頸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。

lncRNAs由長度超過200個核苷酸的非編碼RNA組成，與細胞周期、增殖、生長、凋亡、轉移和侵襲等過程密切相關[12]。研究表明，LINC00461高表達與腎細胞癌患者低生存率有關[13]。LINC00461高表達可促進癌細胞增殖、遷移和侵襲[14-17]。LINC00461高表達可能是肺癌細胞放療抵抗和結直腸癌順鉑耐藥的重要原因[18-19]。為進一步探討益母草堿對宮頸癌的分子機制，本研究檢測益母草堿對SiHa細胞LINC00461表達的影響，結果顯示30 μg·mL-1益母草堿可降低SiHa細胞LINC00461表達水平，提示益母草堿的抗宮頸癌作用可能與抑制LINC00461表達有關。過表達LINC00461后，SiHa細胞存活率、克隆形成能力增加，細胞凋亡率降低，說明LINC00461在宮頸癌中具有致癌作用。此外，過表達LINC00461還可逆轉益母草堿對SiHa細胞存活、克隆形成、凋亡以及相關蛋白表達的影響，這進一步說明益母草堿通過抑制LINC00461發揮抗宮頸癌作用。

綜上，益母草堿通過抑制LINC00461能夠抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，促進細胞凋亡，這為益母草堿在宮頸癌治療中的應用提供了理論支持。本實驗也存在局限性，研究著重體外細胞實驗，關于體內動物實驗需要進一步實驗探究。