大鼠活體肺功能檢測(cè)方法的建立及環(huán)境因素與體質(zhì)量對(duì)其的影響*

王文迪 孫 琦 杜會(huì)博 趙振奧 趙自剛 牛春雨,2

(1.河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，張家口 075000)(2河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，石家莊 050017)

呼吸系統(tǒng)疾病均會(huì)引起肺功能變化，肺功能檢測(cè)(pulmonary function test, PFT)在臨床上常用于慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、特發(fā)性肺纖維化、急性呼吸窘迫綜合征等疾病的診斷[1-3]，對(duì)肺部相關(guān)疾病的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、術(shù)后恢復(fù)、藥物療效評(píng)估等具有重要意義。隨著呼吸系統(tǒng)疾病病理生理與藥理學(xué)研究的進(jìn)展，觀察不同呼吸系統(tǒng)疾病模型動(dòng)物的肺功能變化顯得尤為重要。然而，受實(shí)驗(yàn)條件或儀器設(shè)備的限制，在許多模型動(dòng)物上直接獲取活體肺功能的數(shù)據(jù)、進(jìn)而評(píng)價(jià)肺功能狀態(tài)較難，給研究工作帶來(lái)一定的困擾。本文應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)大鼠進(jìn)行肺功能檢測(cè)，觀察檢測(cè)過(guò)程中外界環(huán)境變化、大鼠體質(zhì)量改變對(duì)肺功能參數(shù)的影響，以期探索出更為穩(wěn)定高效的肺功能檢測(cè)流程，為今后研究人員觀察大鼠活體肺功能狀態(tài)提供較為簡(jiǎn)便可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取40只清潔級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：室溫21～25 ℃，濕度45%～65%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理學(xué)要求，并經(jīng)河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員審查，倫理審批號(hào)：2018-1-9-12。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(DSI公司)，小動(dòng)物麻醉機(jī)(Midmark公司)，小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)(Braintree Scientific公司)，異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)，戊巴比妥鈉(Merck公司)。

1.3 方法

1.3.1大鼠氣管插管：大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，使用3%濃度的異氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉后，再使用1%濃度的戊巴比妥鈉溶液(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。8～10 min后，將大鼠固定于小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，頸部備皮，沿頸部正中切開(kāi)皮下組織，鈍性分離皮下組織充分暴露氣管，于氣管第3～4軟骨環(huán)做環(huán)形切口，擴(kuò)開(kāi)氣管并用內(nèi)直徑3 mm的氣管導(dǎo)管插管，之后用手術(shù)縫合線(xiàn)系緊并固定插入氣管的導(dǎo)管，切忌損傷頸部血管及神經(jīng)，注意防止切口處漏氣(圖1)。穩(wěn)定10 min后進(jìn)行肺功能檢測(cè)。

注：A.切開(kāi)皮下組織；B.鈍性分離皮下組織暴露氣管；C.氣管插管Note: A. The skin and subcutaneous tissue were cut; B. The trachea was isolated by blunt dissection; C. Tracheal intubation was performed圖1 大鼠氣管插管Fig.1 Tracheal intubation in rats

1.3.2肺功能檢測(cè)：檢測(cè)前應(yīng)校準(zhǔn)肺功能檢測(cè)系統(tǒng)，根據(jù)系統(tǒng)提示分別校準(zhǔn)功能殘氣量流量，高流量，肺壓力曲線(xiàn)。在之前報(bào)道[4]的大鼠肢體反應(yīng)狀態(tài)的基礎(chǔ)上，制作大鼠麻醉狀態(tài)鑒別表(表1)，判斷大鼠麻醉狀態(tài)并確保大鼠均處于中度麻醉狀態(tài)。將已行氣管插管術(shù)的大鼠模型放入體積描記艙內(nèi)，等待2 min至大鼠模型適應(yīng)艙體環(huán)境，將氣管導(dǎo)管與呼吸閥連接，合上體積描記艙。應(yīng)用肺功能檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)與分析。

表1 大鼠麻醉狀態(tài)鑒別Table 1 Different levels of anesthesia in rats

1.3.3肺功能檢測(cè)指標(biāo)：檢測(cè)功能殘氣量(functional residual capacity, FRC)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(dynamic compliance, Cdyn)、吸氣阻力(inspiratory resistance, RI)、第100毫秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 100 ms, FEV100)、用力肺活量(forced vital capacity, FVC)、最大呼氣中期流量(mean mid expiratory flow, MMEF)等參數(shù)。各參數(shù)檢測(cè)值由Buxco系統(tǒng)導(dǎo)出。

1.3.4數(shù)據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及注意事項(xiàng)：大鼠氣管插管是肺功能檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵，肺功能檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)避免氣管及導(dǎo)管內(nèi)有血液，黏液等異物。其次，應(yīng)避免導(dǎo)管與氣管切口連接處漏氣；如果發(fā)生漏氣，F(xiàn)RC壓力曲線(xiàn)會(huì)高于基線(xiàn)，F(xiàn)RC數(shù)值偏高(圖2)；當(dāng)發(fā)生漏氣時(shí)，應(yīng)立即停止肺功能檢測(cè)，重新系緊插入氣管的導(dǎo)管后再檢測(cè)。最后，擬合度(R2)≥95%表示數(shù)據(jù)與假設(shè)模型匹配，數(shù)據(jù)可靠，否則應(yīng)舍去數(shù)據(jù)。

注：A.氣密性良好，B.導(dǎo)管與氣管切口連接區(qū)域漏氣Note: A. No air leakage; B. Air leakage at the connection area between tracheal tube and the incision圖2 氣密性判斷Fig.2 The assessment of air tightness of the instrument

1.3.5外界環(huán)境變化對(duì)大鼠肺功能的影響：記錄外界環(huán)境的氣流變化、震動(dòng)因素對(duì)大鼠肺功能檢測(cè)過(guò)程中波形的影響。

1.3.6體質(zhì)量對(duì)大鼠肺功能參數(shù)的影響：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同體質(zhì)量的大鼠肺功能參數(shù)不同。故將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的大鼠按照體質(zhì)量分為兩組。A組：20只，7～8周齡，體質(zhì)量280～300 g；B組：20只，9～10周齡，體質(zhì)量340～370 g。觀察體質(zhì)量對(duì)大鼠肺功能參數(shù)的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量控制

執(zhí)行氣管插管術(shù)后，大鼠均無(wú)死亡情況，存活率為100%。40只大鼠在檢測(cè)肺功能過(guò)程中均處于中度麻醉狀態(tài)，無(wú)漏氣情況。A組R2=99.53%，B組R2=99.73%，表明數(shù)據(jù)可信度高。

2.2 外界環(huán)境變化對(duì)肺功能檢測(cè)的影響

檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，開(kāi)關(guān)門(mén)窗、大幅度動(dòng)作(如跺腳、拍手)等均會(huì)影響壓力傳感器，從而影響肺功能檢測(cè)結(jié)果(圖3)。因此，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定，確保無(wú)氣流波動(dòng)、無(wú)震動(dòng)。

注：A.正常波形；B.開(kāi)關(guān)門(mén)時(shí)波形變化；C.研究人員跺腳時(shí)波形變化；D.研究人員拍手時(shí)波形變化Note: A. Normal waveform; B. Waveforms varied with the door opening and closing; C. Waveforms varied with laboratory personnel stamping their feet; D. Waveforms varied with laboratory personnel clapping their hands圖3 環(huán)境變化干擾壓力傳感器Fig.3 The pressure sensor interfered by environmental changes

2.3 大鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果

兩組大鼠活體肺功能檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。B組(體質(zhì)量較大的大鼠)的FRC、Cdyn、FEV100、FVC、MMEF均顯著高于A組(P<0.05)；兩組間RI沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 大鼠體質(zhì)量對(duì)肺功能指標(biāo)的影響Table 2 The impact of body weight on pulmonary function indices of

3 討論

活體肺功能檢測(cè)對(duì)于監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺功能狀態(tài)具有重要價(jià)值，不僅能反映模型動(dòng)物在活體狀態(tài)下肺功能障礙或肺損傷的情況，還能反映藥物等干預(yù)措施對(duì)模型動(dòng)物的干預(yù)效果。功能殘氣量(FRC)表示平靜呼氣末殘留于肺內(nèi)的氣體體積，具有維持呼氣末期肺容積，保持氣道開(kāi)放并為呼吸循環(huán)供氧的作用。FRC增高常見(jiàn)于慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫、哮喘等；而肺水腫、肺間質(zhì)纖維化、肺炎及急性呼吸窘迫綜合征等則會(huì)造成FRC減小[5]。肺順應(yīng)性指單位壓力改變引起肺容積的變化，其與肺組織彈性相關(guān)。動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)指在呼吸周期中，氣流未阻斷時(shí)測(cè)得的肺順應(yīng)性。肺順應(yīng)性增大常見(jiàn)于肺氣腫；肺順應(yīng)性降低見(jiàn)于肺纖維化、急性呼吸窘迫綜合征、肺炎實(shí)變等[6]。吸氣阻力(RI)指在呼吸過(guò)程中氣流產(chǎn)生的黏性阻力，可隨著呼吸發(fā)生周期性改變。RI升高常見(jiàn)于氣道慢性炎性反應(yīng)、氣道狹窄、氣道肌層增厚及上皮下基膜增厚時(shí)[7]，如慢性阻塞性肺疾病，支氣管哮喘；RI降低常見(jiàn)于支氣管擴(kuò)張等疾病。第100毫秒用力呼氣容積(FEV100)是深吸氣后用力快速呼氣第100毫秒呼出的氣體量。FEV100降低常見(jiàn)于肺纖維化和肺氣腫。用力肺活量(FVC)指深吸氣后快速用力呼氣所得到的最大氣體量。FVC升高常見(jiàn)于支氣管擴(kuò)張；FVC降低常見(jiàn)于重度慢性阻塞性肺疾病、限制性通氣障礙、呼吸機(jī)力減弱等[6]。通常第100毫秒用力呼氣容積與用力肺活量之比(FEV100/FVC)是反映氣道是否阻塞的指標(biāo)。最大呼氣中期流量(MMEF)是用力呼出肺活量25%～75%的平均流量[8]，其臨床意義與FVC相似，是判斷氣道阻塞，尤其是小氣道病變的重要參考指標(biāo)。

大鼠氣管插管是肺功能檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵。大鼠氣管肺功能檢測(cè)過(guò)程中對(duì)氣密性要求嚴(yán)格，因此，在大鼠氣管插管過(guò)程中，應(yīng)防止切口區(qū)域漏氣，同時(shí)應(yīng)避免氣管及導(dǎo)管內(nèi)有血液及黏液等異物。檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定；開(kāi)關(guān)門(mén)窗，大幅度動(dòng)作(如跺腳、拍手)等均會(huì)影響壓力傳感器進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果；因此建議在肺功能檢測(cè)過(guò)程中，避免人員走動(dòng)及門(mén)窗開(kāi)合。此外，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠體質(zhì)量差異對(duì)大鼠肺功能檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)有影響，但對(duì)吸氣阻力沒(méi)有明顯影響，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制組間大鼠的體質(zhì)量。

綜上所述，本研究提供了簡(jiǎn)便可靠的大鼠肺功能檢測(cè)方法，成功率高，為研究呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)研究工作提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。