程序性壞死在腎纖維化中的研究進展

周賢，李六生

（三峽大學人民醫院腎內科，湖北 宜昌 443000）

0 引言

眾所周知，腎纖維化是各種慢性腎臟病（Chronic kidney disease,CKD）發展致終末期腎病的最終共同途徑，病理表現為腎小管萎縮、間質纖維化和腎小球硬化。既往研究表明，腎小管間質纖維化與炎癥、細胞死亡、細胞外基質增殖和上皮間充質轉化等因素有關[1]，組織損傷和無菌性炎癥是腎纖維化進展的重要觸發因素，損傷后壞死細胞釋放損傷相關分子模式（Damage-associated molecular patterns,DAMPs），導致與壞死相關的無菌炎癥反應[2]。然而，潛在的分子機制尚未確定，尚缺乏有效的治療方法。因此，深入探討腎纖維化發生的機制，尋找新的治療靶點，對于降低CKD的發病率具有重要的意義。近年的研究發現，程序性壞死在腎纖維化中發揮重要的作用，目前成為腎臟病領域研究的熱點。本文就近年來程序性壞死在腎纖維化中的作用機制以及程序性壞死作為抗腎纖維化治療靶點的研究進展進行綜述，為腎纖維化的防治提供新的思路。

1 程序性壞死的發生機制

程序性壞死是一種新的、不依賴于半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)的調節性細胞死亡類型，其主要特征是細胞腫脹和細胞膜破裂。程序性壞死涉及受體相互作用蛋白 激 酶1（Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）和受體相互作用蛋白激酶3（Receptorinteracting protein kinase 3，RIPK3）以及下游底物混合系列蛋白激酶樣結構域（Mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）。當RIPK1磷 酸 化RIPK3后，磷酸化的RIPK3激活MLKL，最終導致質膜破裂并將促炎細胞內容物釋放到細胞外空間[3]。有研究報道，RIPK3/MLKL介導的程序性壞死可以導致腎小管間質損傷和腎臟缺血-再灌注損傷相關的間質纖維化[4,5]。程序性壞死受多種細胞內、外刺激調控，包括腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)家族成員、自殺相關因子（Factor associated suicide，Fas）配體、干擾素、氧化應激等。盡管Fas和TNF相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）受體都以與caspase介導的凋亡相關而聞名，但有研究表明，盡管應用caspase抑制劑，細胞死亡仍會發生[6]。為了了解程序性壞死的相關機制，TNF-α誘導的程序性壞死是最廣泛的途徑。程序性壞死途徑受RIPK1和RIPK3以及MLKL的調控。在與死亡受體TNF受體1 (TNFR1)結合后，相繼招募各種下游分子。RIPK1通過受體相互作用蛋白招募RIPK3，RIPK1和RIPK3磷酸化，然后通過蘇氨酸357和絲氨酸358位點的磷酸化激活MLKL[7]。p-MLKL通過與質膜中的磷脂酰肌醇磷酸結合，引起膜通透性改變，誘導細胞外鈣內流和質膜穿孔，導致程序性壞死[8]。隨后，損傷相關分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)，如高遷移率組盒1、熱休克蛋白和線粒體DNA被釋放，這些細胞外釋放的DAMPs可激活浸潤性免疫細胞，隨后釋放細胞因子，促進炎癥反應[9]。

2 腎纖維化

腎纖維化不僅是各種進行性慢性腎臟疾病的標志和共同途徑，也是腎功能不全的主要決定因素和可靠的預后指標，主要表現為硬化、腎小管萎縮和腎間質纖維化[10]。CKD以腎臟結構受損、功能下降為特征，是由炎癥、代謝紊亂、毒物等因素引起的一組常見的慢性疾病。隨著人口老齡化和糖尿病、高血壓的增加，CKD的患病率不斷上升，約占成人人口的10%-13%[11]。不同程度的CKD有不同的初始進化，這與其病因的多樣性(如遺傳、性別、自身免疫相關感染、環境因素、飲食和藥物)有關[12]。腎臟疾病中受損的腎實質細胞通常因病因而異。當發病機制為腎小管中毒、梗阻、缺血等時，首先受到損傷的是腎小管上皮細胞，然后發生腎間質纖維化[13]。相當多的患者最終發展為終末期腎病，需要終生透析或腎移植。此外，在CKD發生的慢性損傷過程中，腎組織在實質內形成瘢痕，腎臟結構發生破壞，最終破壞腎功能。纖維化降低了自我修復的能力，最終導致腎衰竭。本質上，腎纖維化的形成被認為是各種腎損傷愈合失敗的過程。腎臟受到損傷后，激活多種細胞，包括內皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、肥大細胞等滲透性細胞啟動進化保守的損傷修復防御程序來抵抗損傷[14]。雖然腎纖維化的病因多種多樣，但其發生機制是相同的。腎小管間質纖維化的形成主要由四個部分組成：腎損傷后炎癥反應的激活和炎癥細胞的浸潤、前成纖維細胞的釋放、成纖維細胞的活化和擴增導致大量ECM沉積和腎結構和功能受損，腎小管萎縮，微血管減少[15]。每一個病理過程都能以其獨特的方式導致纖維化的進展，共同構成一系列核心纖維化事件，最終導致腎實質的破壞和腎功能的喪失。腎纖維化是威脅人類生命和健康的嚴重問題，至今仍缺乏有效的治療策略。因此，人們開始關注腎纖維化發生發展的機制，尋找有效的干預策略，這也是現階段克服該疾病的重點和難點。

3 程序性壞死與腎纖維化

3.1 程序性壞死介導的炎癥反應與腎纖維化

不受控制或過度的炎癥可導致進行性腎損傷，這也被認為是腎纖維化的初始階段。在糖尿病腎病、敗血癥引起的急性腎損傷、單側輸尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）模型中，壞死的腎小管細胞通過釋放組蛋白、熱休克蛋白等損傷相關分子模式觸發腎實質細胞信號通路的激活來驅動炎癥反應[16]。程序性壞死導致細胞質膜破裂以致細胞因子釋放、血管通透性增加，形成無菌性炎癥。細胞壞死和壞死相關的免疫激活加速了壞死性炎癥。壞死性炎癥可通過少量壞死細胞啟動先天免疫系統，隨后誘導更多細胞壞死觸發更強的炎癥反應，最終可能導致整個器官衰竭[17]。在這一病理過程中，缺血、毒素和白蛋白尿可引起小管間質炎癥，而小管間質炎癥可引起腎小管上皮細胞損傷，加重小管間質炎癥。它在腎小管上皮細胞損傷和炎癥之間形成了一個循環。調節這種平衡可能對抑制腎纖維化的發展至關重要。根據以往的研究，細胞壞死的發生是由受體和感受器通過不同的刺激介導的，如腫瘤壞死因子受體、干擾素受體，這些可導致激活后壞死體的形成。死亡細胞釋放的DAMPs可以通過包括炎癥小體模式識別受體激活先天免疫反應，也可以誘導腎實質細胞和炎癥細胞炎癥反應[18]。DAMPs調節小管損傷和小管間質炎癥，阻斷DAMPs似乎是緩解腎臟損害進展的一種策略。

腎臟細胞死亡和無菌性炎癥是腎纖維化的主要機制，最終可發展為終末期腎病。在臨床腎移植中，腎纖維化和腎小管萎縮區域的炎癥與慢性腎小球病變以及腎功能下降有關[19]。研究發現，慢性腎纖維化患者與腎移植后恢復良好的患者相比，RIPK3表達上調。通過對RIPK3過表達后的程序性壞死相關指標進行檢測，發現RIPK3和MLKL的磷酸化水平明顯升高，乳酸脫氫酶釋放水平升高。在程序性壞死過程中，細胞可以釋放損傷相關的分子模式，這些分子可以在沒有感染的情況下引發炎癥反應[20]。加入程序性壞死MLKL抑制劑（Necrosulfonamide,NSA）后，炎癥反應明顯減輕[21]。活性氧（reactive oxygen specie，ROS）是指需氧細胞產生的氧的某些代謝產物和一些反應的含氧產物,ROS是細胞損傷的重要介質，脂質過氧化是ROS誘導的氧化應激的最重要原因[22]。研究表明過表達RIPK3后，ROS的產生顯著增加。去除過量的ROS后，程序性壞死和炎癥均在很大程度上恢復。這些結果表明ROS與程序性壞死和炎癥密切相關。核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）是一種轉錄因子，調節多個基因的表達水平，并控制各種細胞功能，包括炎癥和壞死信號傳導[23-24]。RIPK3過表達可有效激活NF-κB信號通路，且該激活可被ROS清除劑N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acety,NAC)顯著抑制，提示ROS是NF-κB通路中的重要介質。隨后，用NF-κB抑制劑處理細胞，發現細胞壞死和RIP3誘導的炎癥反應也受到抑制。總的來說，這些結果表明程序性壞死是通過依賴于ROS的NF-κB通路誘導炎癥的[25]。總之，CKD患者出現腎纖維化，可能的機制是程序性壞死的激活導致炎癥反應，并最終導致患者腎纖維化的形成。

3.2 程序性壞死與腎纖維化信號通路TGF-β1

轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是調控腎纖維化的關鍵因子，根據靶細胞類型和微環境可誘導不同的細胞應答反應。TGF-β在多種組織的炎癥、增殖、分化和愈合中發揮多種穩態調節作用。許多研究表明，TGF-β刺激成纖維細胞的活化和增殖，導致細胞外基質沉積。其表達的增加可導致許多纖維化疾病，其表達水平往往與疾病的嚴重程度相關。在此基礎上，抑制TGF-β及其活性在治療各種纖維化疾病如肺纖維化、腎纖維化、系統性硬化等方面具有巨大的治療潛力。通過了解TGF-β信號轉導和活性的分子機制，研究者可以制定不同的策略來調節TGF-β的活性。許多小分子抑制劑已被開發用于抑制TGF-β受體的胞質結構域和細胞內信號分子。在哺乳動物中已發現TGF-β的三種亞型，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[26]。為了將TGF-β復合物切割成活性成分并釋放活性TGF-β，需要一種或多種多種蛋白酶，包括纖溶酶、基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9、血栓反應蛋白、整合素和甘露糖6磷酸受體[27]。過度表達活躍TGF-β1可誘導包括腎臟在內的多個器官的纖維化反應，這已被廣泛接受。TGF-β1直接或間接作用于各種細胞類型，是小管間質纖維化發病機制中的關鍵介質[28]。TGF-β1的直接作用包括細胞向成纖維細胞表型的轉化和合成成纖維蛋白，如膠原和纖維連接蛋白[29]。TGF-β1也促進間接纖維化反應，通過加速駐留健康細胞的凋亡，促進駐留細胞和浸潤細胞增加ECM沉積[30]。在腎纖維化動物模型中抑制TGF-β1可減弱成纖維細胞活化和ECM積累[30]。TGF-β1的中樞信號轉導是由兩個特異性受體介導的，即TGF-β Ⅱ型受體、和TGF-β Ⅰ型受體。

TGF-β在纖維化組織中被誘導激活，并與多種不同器官纖維化的發病機理有關[31]。TGF-β1水平升高與CKD病情進展及腎間質纖維化相關,并可作為CKD患者腎纖維化病情診斷的預測指標[32]。Imamura等 人[33]的研究 表 明，在UUO腎纖維化模型中，RIPK3缺乏可以延緩腎纖維化。IL-1β，NLRP3炎 癥 小 體 可 加 強TGF-β1的 轉錄[34]。RIPK3可 以 調 控NLRP3炎 癥 小 體[35]，在RIPK3信號通路中，促進NLRP3炎癥小體激活的觸發機制尚不清楚。在使用腎成纖維細胞的體外研究中，RIPK3抑制劑GSK’872或RIPK1抑制劑（necrostatin-1，Nec-1）消除了TGF-β依賴的細胞外基質（Extracellular matrix,ECM）和α-平滑肌肌動蛋白的表達[33]，表明壞死小體（RIPK1/RIPK3）是TGF-β在刺激ECM沉積和成纖維細胞激活中的下游調節因子。壞死小體-依賴的ATP檸檬酸裂解酶通路此前已被確定為TGF-β下游。TGF-β活化激酶1 (TAK1)與TGFβ1相互作用，通過TGF-β1/TAK1/MKK3/p38MAPK、TGFβ1/TAK1/MKK4/JNK和TGF-β1/TAK1/ NF-κB信號通路促進器官纖維化的發生發展[36]。上述研究提示，腎纖維化中患者TGF-β下游通路激活，程序性壞死標記物升高，表明程序性壞死和TGF-β介導的通路參與了腎纖維化的形成。

3.3 程序性壞死抑制劑與腎纖維化

抗腎纖維化治療是防治CKD的重要措施，針對下游TGF-β1信號通路來預防腎臟疾病不太可能是有效的，開發靶向性更強的下游通路的阻斷劑，如程序性壞死通路抑制劑可能更有益[37]。到目前為止，已經研究出幾種小分子化合物可以抑制RIPK3活性[38]。這些RIPK3的抑制劑可以分為三種類型:以位于兩個催化結構域之間的ATP結合活性位點為靶點的ATP模擬抑制劑、以非激活狀態為靶點抑制劑及未分類的抑制劑[39]。GSK’872是RIPK3選擇性激酶中應用最廣泛的細胞滲透性抑制劑，并已被用于特異性抑制RIPK3[40]。絲氨酸/蘇氨酸激酶B-Raf V600E抑制劑是唯一獲得批準使用的RIPK3抑制劑[41]。總之，抑制程序性壞死是一種很有前途的抗腎纖維化策略。RIPK3刺激TGF-β1下游活化級聯，并通過NLRP3炎癥小體激活調控TGF-β1轉錄。近年的研究發現，氟非尼酮可改善腎纖維化和相關炎癥[42]。采用UUO誘導小鼠腎小管間質纖維化，同時給予氟非尼酮或Nec-1后，氟非尼酮和Nec-1改善了腎小管損傷、炎性細胞浸潤和膠原沉積，并降低了促炎因子（IL-1β、TNF-α）和趨化因子的表達。氟非尼酮或Nec-1治療可減少腎小管上皮細胞發生程序性壞死，并減少血清中乳酸脫氫酶的釋放，RIPK3和MLKL的產生也減少。氟非尼酮和Nec-1顯著降低TNF-α刺激的人近端腎小管上皮細胞的程序性壞死百分比，抑制MLKL和RIPK3的磷酸化。總之，氟非尼酮和Nec-1在單側輸尿管梗阻誘導的腎纖維化模型中具有有效的抗炎和抗纖維化活性[43]。

在腎缺血再灌注小鼠模型中，通過敲除小鼠RIPK3或MLKL基因，腎小管上皮細胞死亡減少，而且炎癥細胞浸潤和腎纖維化減輕，巨噬細胞和T淋巴細胞等炎癥細胞的招募是導致腎損傷后持續炎癥和隨后纖維化反應的原因[44]。在單側輸尿管梗阻誘導小鼠腎小管間質纖維化模型中，Nec-1抑制程序性壞死減輕了小鼠腎纖維化，與降低RIPK3、MLKL、TGF-β1的蛋白和mRNA表達有關。腎臟膠原蛋白的積累和成纖維細胞激活減少[5]。慶大霉素是一種針對革蘭氏陰性菌的強效氨基糖苷類抗生素，但其腎毒性限制了其臨床應用。慶大霉素誘導急性腎損傷的原因主要歸因于近端小管細胞的凋亡，然而，阻斷細胞凋亡只能部分減弱慶大霉素誘導的急性腎損傷[45]，用慶大霉素誘導小鼠發生急性腎損傷，MLKL、RIPK3表達上調，Nec-1可減輕慶大霉素誘導的程序性壞死以及MLKL和RIPK3的上調，同時Nec-1減輕了腎臟炎癥和纖維化，并顯著改善了慶大霉素誘導的小鼠腎功能障礙[46]。此外，Nec-1 對腎臟、肝臟和心血管系統有保護作用，這意味著 Nec-1 或其衍生物也可能延緩腎功能的惡化[47]。

4 展望

程序性壞死是近年來新發現的一種不依賴于caspase調節的新型細胞死亡途徑，在腎臟疾病中的研究剛起步，雖然程序性壞死在腎纖維化中作用機制的研究已經取得一定進展，但其調控網絡非常復雜，具體信號途徑并不完全清楚，哪些因素可以觸發以及如何觸發程序性壞死等問題還需要進一步研究。目前發現靶向抑制程序性壞死發生過程中的一些關鍵分子RIPK1、RIPK3，有望預防腎纖維化的進展，有理由相信隨著對程序性壞死調控和阻斷機制研究的進一步闡明，將為腎纖維化的防治提供新的策略。因此，進一步探討程序性壞死相關通路在腎纖維化中的作用，有利于明確腎纖維化的機制，并且對腎纖維化的治療靶點確證以及靶向藥物的研究具有重要意義。