鹽酸二甲胺四環素用于牙周炎的緩釋原位凝膠新劑型的研究

陳少壯 葉巖榮 沈 赟 劉 佳

1.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院藥劑科，福建 廈門 361015；

2.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院中西醫結合科，福建 廈門 361015

牙周病是指在牙周組織發生的疾病，是導致牙齒脫落的主要原因，同時也是導致某些疾病的重要因素，如卒中和冠心病等[1]。牙周局部緩釋給藥系統的優點：避免首過效應、藥物貯留時間延長，減少頻繁給藥、與吸收面直接接觸，提高藥物的吸收；維持有效藥物濃度。缺點：給藥時患者牙周袋意外膨脹[2]；需專門裝置給藥。原位凝膠即在位凝膠，是一類以溶液狀態給藥后，能在用藥部位立即發生相轉變，由液態轉化形成非化學交聯半固體凝膠的制劑。其相轉變的方式有溫度敏感[3]、去除溶劑沉淀、酸堿度敏感[4]和離子敏感[5]等多種類型。原位凝膠給藥系統同時具備了固體植入劑在局部貯留、緩慢釋藥和微粒給藥系統的可注射性的優勢[6]。

鹽酸二甲胺四環素（minomycin hydrochloride，MINO·HCl）是治療牙周病的主要藥物[7]，其不影響其他組織的新陳代謝。MINO·HCl 有更廣的抗菌譜和更強的抗菌活性[8]，其對大部分牙周致病菌如牙齦炎桿菌和伴放線桿菌等有明顯的抑制作用[9]。MINO·HCl 能降低牙周炎癥的宿主反應，促進牙周組織膠原的合成與表達。

在牙周病原位凝膠給藥系統中加入透明質酸具有多方面優勢。透明質酸作為一種高分子酸性黏多糖[10]，有多種重要的生理功能，如調節血管壁的通透性[11]，調節蛋白質、水、電解質擴散及運轉和促進創傷愈合等。在給藥系統中加入透明質酸，可以增大牙周組織細胞膜的通透性，使藥物達到更好的吸收率。并且作為高分子聚合物，透明質酸溶于水中能夠形成具有一定黏度的膠狀物質，可以保護原位凝膠在相轉變初期不被齦溝液所帶出。同時，在牙周組織的愈合過程中，透明質酸也能起到促進作用[12]。

因此，本研究根據去除溶劑沉淀的原理[13]制備緩釋原位凝膠，在牙周袋內注射入緩釋原位凝膠，其接觸齦溝液后，溶劑擴散并溶于水中，難溶的共聚物沉淀形成凝膠并緩慢釋放藥物，達到局部治療牙周病的目的，并且該共聚物可生物降解。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

JB-1 型攪拌器（上海雷磁新涇儀器儀器有限公司）；AR124CN 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；BA110S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；NDJ-8S型數字顯示黏度計（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；JJ-1 型精密增力電動攪拌器（常州國華電器有限公司）；UV-2600 型紫外分光光度計（日本島津公司）

1.2 試劑

MINO·HCl（上海源葉生物科技有限公司，批號：H25J7B9464）；透明質酸[（hyaluronic acid，HA)，上海麥克林生化科技有限公司，批號：P208761]；N- 乙 烯 基 吡 咯 烷 酮[（N-vinyl-2-pyrrolidone，NVP），美國Sigma-Aldrich 公司，批號：122590HH]；N- 甲 基 吡 咯 烷 酮[（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP），國藥集團化學試劑有限公司，批號：H03556J]；二甲基亞砜[（dimethyl sulfoxide，DMSO），西隴化工股份有限公司，批號：03A19744]；三乙酸甘油酯[（triacetin，GTA），上海源葉生物科技有限公司，批號：117632]；聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lacticco-glycolic acid），PLGA50 ∶50，Mw：10000，濟南岱罡生物材料有限公司，批號：420892S]；甲基丙烯酸氨烷基酯共聚物E 型（aminoalkyl methacrylate copolymer E，Eudragit?E100，德國羅姆公司，批號：AKS3402）；磷酸鹽緩沖液[（phosphate buffer solution，PBS），福州科諾生物有限公司，批號：0039427]；MINO·HCl軟膏（新時代藥業有限公司，批號：AR0862）；甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：0103611）。

2 方法

2.1 處方篩選

2.1.1 基質的選擇 PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100的降解產物對人體無刺激、無毒，具有良好的生物相容性[14]，因此選用這二者通過實驗進行處方篩選。

2.1.2 有機溶劑的選擇 NMP、NVP、DMSO 和GTA均可與水互溶[15]，且對人體毒性較低、生物相容性較好，本實驗對HA、PLGA50 ∶50、Eudragit?E100 在上述四種溶劑中的溶解度進行了對比實驗。分別稱取HA、PLGA50 ∶50、Eudragit?E100 三種物質20 mg 于4 個燒杯中，分別加入20 ml 的有機溶劑：NMP、NVP、DMSO 和GTA，放置于室溫，觀察溶解情況，并記錄溶解時間。

2.2 制備工藝

2.2.1 制備的方法 稱取HA 和共聚物分別溶于NVP 和NMP 中攪拌溶解，然后稱取MINO·HCl 加入其中并攪拌溶解，制成MINO·HCl 緩釋原位凝膠。2.2.2 通針性試驗 按照“2.2.1”項下的制備方法，MINO·HCl 濃度為10%，用PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100 分別制備共聚物濃度為20%和30%的緩釋原位凝膠，通過5 ml 注射器（6 號針頭）試驗兩份原位凝膠的通針性。

2.2.3 凝固情況試驗 按照“2.2.1”項下的制備方法，MINO·HCl 濃度為10%，用PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100 分別制備共聚物濃度為20%和30%的緩釋原位凝膠，將其分別注射入PBS 中，觀察凝固情況。

2.3 質量評價

2.3.1 觀察形態 觀察空白原位凝膠和MINO·HCl 緩釋原位凝膠的外觀形態。

2.3.2 考察通針性 根據處方制備3 批MINO·HCl緩釋原位凝膠，通過5 ml 注射器（6 號針頭）考察其通針性。

2.3.3 黏度測定 根據處方制備MINO·HCl 緩釋原位凝膠，室溫條件下使用旋轉黏度計（2 號轉子，60 rpm）來測定其黏度。

2.4 含量測定

本含量測定方法采用紫外分光光度法進行含量測定。選擇適宜的溶劑將原位凝膠中的MINO·HCl 溶解后，通過紫外分光光度計，測定原位凝膠中MINO·HCl 的含量。

2.4.1 波長的選擇 精密稱取2 mg MINO·HCl于100 ml 棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容到刻度，得到濃度為20 μg/ml 的MINO·HCl 溶液，用紫外分光光度計在200 ～600 nm 下掃描波長。再取適量的空白原位凝膠（約20 mg）于100 ml 的甲醇中充分溶解，取上清液在200 ～600 nm 下掃描波長。

2.4.2 標準曲線的建立 精密稱取25 mg MINO·HCl于25 ml 棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，得到濃度1 mg/ml 的儲備液。用甲醇分別稀釋成 濃 度 為6、10、14、18、22、26、30 μg/ml 的 溶 液。以甲醇作為對照，在檢測波長下測定3 次吸光度，計算平均值。以濃度對吸光度做線性回歸方程。

2.4.3 樣品含量測定 根據處方制備3 批MINO·HCl 緩釋原位凝膠，分別取20 mg 于100 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，超聲30 min使其充分溶解，再取上清液用上述紫外分光光度法測定3 批緩釋原位凝膠中MINO·HCl 的含量。

2.5 體外釋放研究

通過對MINO·HCl 緩釋原位凝膠和MINO·HCl軟膏二者體外釋放的比較，對MINO·HCl 緩釋原位凝膠的體外釋放結果進行評價。

取MINO·HCl 緩釋原位凝膠和MINO·HCl 軟膏各300 mg 分別加入到含10 ml PBS（0.01 mol/ml，pH 7.4）的西林瓶中，置于恒溫加熱磁力攪拌器，設定轉速為80 rpm，溫度為37℃，分別在2、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 后將西林瓶中液體取出，同時補充37℃的PBS 10 ml。用甲醇分別將取出的溶液稀釋至合適的濃度后，以同等稀釋倍數的PBS 為對照組，于檢測波長下測定其吸光度，通過“2.4.2”得到的方程分別計算二者的濃度和累積釋放百分率，以時間對累計釋放百分率做藥物釋放曲線。

3 結果與討論

3.1 處方篩選

對于有機溶劑的選擇，試驗結果表明，HA 在NVP 中易溶，在NMP、DMSO 和GTA 中均微溶或難溶，見表1。PLGA50 ∶50、Eudragit?E100 在NMP 和DMSO 中均可以較快溶解，在NVP 中溶解較慢，在GTA 中難以溶解，見表2。DMSO 具有強烈的大蒜的難聞氣味，NMP 無難聞氣味，安全無毒，生物相容性良好。因此，選用NMP 作為溶劑，NVP 作為助溶劑。

表1 HA在四種有機溶劑中的溶解情況

表2 不同共聚物在四種有機溶劑中溶解所需要的時間（h）

3.2 制備工藝

3.2.1 通針性試驗 試驗結果表明，PLGA50 ∶50和Eudragit?E100 濃 度 為20% 時，其 通 針 性 較好，且相同濃度下Eudragit?E100 的通針性優于PLGA50 ∶50。共聚物的濃度越小，所制成的原位凝膠通針性越好。見表3。

表3 不同原位凝膠的通針性試驗結果

3.2.2 凝固情況試驗 PLGA50 ∶50 和Eudragit?E100濃 度 為30% 時，其 凝 固 速 度 較 快。 且 用PLGA50 ∶50 制成的原位凝膠比用Eudragit?E100制成的原位凝膠在PBS 中凝固更快，成型性更好，骨架更完整。見表4。因此，選擇PLGA50 ∶50 為基質，濃度為30%。

表4 不同原位凝膠在磷酸鹽緩沖液中的凝固情況

3.3 質量評價

3.3.1 觀察形態 空白原位凝膠為透明黃色液體，色澤均勻，流動性良好。見圖1。MINO·HCl 緩釋原位凝膠為均勻的棕色透明液體，加入到PBS 中凝固成凝膠狀固體。見圖2。

圖1 空白原位凝膠

圖2 MINO·HCl 緩釋原位凝膠在磷酸鹽緩沖液中凝固

3.3.2 考察通針性 3 批MINO·HCl 緩釋原位凝膠，均可以通過5 ml 注射器（6 號針頭），其通針性較好。

3.3.3 黏度測定 緩釋原位凝膠的黏度為（292.0±5.4）mPa·s，原位凝膠黏度在200 ～300 mPa·s內既可以用于注射，也可以保證其在液體中凝固初期不發生擴散，因此其黏度良好，可用于注射。

3.4 含量測定

3.4.1 波長的選擇 MINO·HCl 在波長344 nm處有最大吸收，其他成分在波長344 nm 處不影響對MINO·HCl 的測定，因此波長344 nm 作為MINO·HCl 的測定波長。見圖3。

圖3 MINO·HCl 和輔料的波長掃描

3.4.2 標準曲線的建立 根據溶液在不同濃度下測得的吸光度，得到線性回歸方程：A=0.024C-0.0058，R2=0.9998，MINO·HCl 在6 ～30 μg/ml 范圍內線性關系良好，見圖4。

圖4 紫外分光光度法測定MINO·HCl 的標準曲線

3.4.3 樣品含量測定 測定的3 批樣品含量分別 為99.79%、99.21% 和100.86%，含 量 范 圍 為（100±1）%，含量均符合要求。

3.5 體外釋放研究

原位凝膠在第1 天有37.40%的快速釋放，之后便可穩定持續地釋放藥物，在第7 天累積釋放達到90.53%，具有良好的緩釋效果；而MINO·HCl軟膏在第1 天累積釋放便高達66.97%，在第3 天就達到了91.71%。因此，MINO·HCl 緩釋原位凝膠具有良好的緩釋作用。見圖5。

圖5 MINO·HCl 緩釋原位凝膠和軟膏的藥物釋放曲線

4 總結與展望

本研究確定了MINO·HCl 緩釋原位凝膠的處方成分包括：PLGA50 ∶50、MINO·HCl、HA，NMP、NVP；制成了一種能夠以注射給藥的緩釋原位凝膠新劑型，其在牙周袋內注入，接觸齦溝液后，溶劑擴散并溶于水中，難溶的共聚物沉淀形成凝膠貯留于牙周袋內并緩慢釋放藥物，達到局部治療牙周病的目的。后續將進一步研究各處方成分的最適濃度；研究該原位凝膠的體外釋放模型；考察該原位凝膠制備工藝的穩定性；以及進一步研究HA的加入所帶來的優勢。