宏基因組二代測序在伴有中樞神經系統受累兒童噬血細胞綜合征中的應用價值

張海洋 唐茂婷 卿露 李德淵 喬莉娜

（四川大學華西第二醫院兒童重癥醫學科/出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川成都 610041）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）為皰疹病毒科γ亞科，是一種嗜人類淋巴細胞的皰疹病毒，在正常人群中感染非常普遍，90%以上的成人血清EBV抗體呈陽性。原發性EBV感染典型表現為傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM），在嬰幼兒中也可為無癥狀或其他不典型臨床表現。噬血細胞綜合征（hemophagocytic syndrome，HPS）是一類兒童高發的系統性高炎癥反應綜合征，臨床特點為細胞因子風暴引起的過度炎癥反應導致的臟器損傷，其起病急，進展迅速，嚴重者未經及時治療可發展為多器官功能衰竭，危及生命。感染可引起原發性或繼發性HPS，致病微生物以EBV最多見，EBV感染的不同狀態均可引發HPS［1］。HPS易合并中樞神經系統危急癥狀，常為暴發性疾病，預后極差［2］。既往經驗可以印證HPS產生的炎癥風暴可使顱內受累，但顱內病理生理狀況未知，無法區分免疫風暴或EBV感染引起的病毒性腦炎。疑似中樞神經系統感染的病例應盡早進行腦脊液檢查以明確診斷，而目前兒童EBV相關HPS的治療指南均未提及對顱內EBV感染的檢測［3-4］，傳統EBV檢測手段存在諸多局限性［5-7］，且聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測腦脊液EBV-DNA的靈敏度尚未有確切的臨床數據。

宏基因組二代測序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）技術是基于基因組學的病原學檢測技術［8-9］，其無需培養、無需預判，且效率高，大部分檢測機構能在24 h內出具報告，能精準識別感染的病原體，已廣泛在危重、復雜的腦炎、腦膜炎的診斷中應用［10-12］。在過去的二十年里，盡管病原體特異性檢測（如PCR病毒核酸檢測和特異性抗體檢測）取得了一定進展，但腦炎患者的診斷率仍然很低［13］。本研究采用mNGS檢測有中樞神經系統受累癥狀的HPS患兒的腦脊液，尋找此類患兒顱內EBV感染的依據，以明確EBV相關HPS是否容易誘發EBV感染引起的病毒性腦炎。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2020年1月—2022年4月我院兒童重癥監護室（pediatric intensive care unit，PICU）收治的EBV相關HPS患兒30例。納入標準：（1）符合2004年HPS診斷標準（HLH-2004）及《噬血細胞綜合征診治中國專家共識》的診斷標準［1，3-4］；（2）血 清EBV-DNA>400拷 貝/mL；（3）伴有中樞神經系統癥狀；（4）腦脊液mNGS檢出EBV。排除標準：資料不完善或失訪者，無明確臨床診斷者。所有患兒監護人均知情同意，本研究通過我院倫理委員會批準（醫學科研-2021-申181）。

1.2 生化檢測

腦脊液的采集：入院72 h內通過腰椎穿刺術抽取腦脊液約5 mL，存放于低吸附無菌采樣管，采樣過程嚴格控制無菌，采集后立即送檢mNGS和PCR檢測。

血清學檢測：采集初次擬診為伴有中樞神經系統受累患兒的外周靜脈血，分別行血常規、肝腎功能、鐵蛋白、凝血功能、血脂、腦脊液EBVDNA定性檢測、血清EBV-DNA定量檢測及血清EBV抗體譜檢測。血清EBV-DNA≥1×103拷貝/mL可視為異常［14］。

腦脊液PCR檢測：取200 μL腦脊液樣本提取DNA，采用實時熒光PCR分析（熒光定量Q5，賽默飛，美國），對檢測結果進行確認（腦脊液PCR操作及質控須符合院內標準操作規范的要求）。

1.3 mNGS方法

DNA提取與質控：取200 μL腦脊液樣本于室溫下5 000 r/min離心10 min取上清液，使用天根核酸提取試劑盒（DP316，北京天根生化科技有限公司）提取上清液中的DNA并完成純化，每批樣本檢測設置不添加任何微生物的陰性對照，以及加入混合菌的陽性對照，用Qubit 2.0（Thermo Fisher，美國）和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA含量，進行質控。參照DNA文庫構建試劑盒（Illumina）操作手冊，在待測DNA片段兩頭加上能與測序儀器識別的已知序列片段，進行擴增與富集，采用Agilent 2100 Bioanalyzer（安捷倫，美國）完成文庫質控。在Illumina二代測序平臺Nextseq 550Dx上進行75 bp單端高通量測序。

1.4 生物信息學分析與陽性標準

使用Fastp軟件去除原始數據中低質量、重復、冗余片段及接頭序列，獲得高質量數據，通過Bowtie2比對人源參考基因組數據庫去除人源宿主序列，未比對上的數據與自建微生物（包括細菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲）數據庫進行鑒定。

mNGS檢測的陽性標準：一般情況下認為正常人腦脊液是絕對無菌的，檢測到微生物即考慮為病原體檢出，將檢出序列數≥3定為結果陽性。

1.5 統計學分析

采用 SPSS 25.0統計軟件進行數據處理分析與圖形繪制。計量資料以中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，計數資料以例數和率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關，采用多元線性回歸方法分析影響腦脊液mNGS EBV檢出序列數的臨床指標。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 30例患兒的臨床資料

30例患兒中位年齡為3.0（0.7，6.5）歲，骨髓涂片均有噬血現象，其中2例有家族性噬血基因?；純壕憩F出煩躁不安、抽搐、嗜睡等神經系統癥狀，合并腦脊液白細胞及蛋白水平正?；蜉p度增高，腦脊液mNGS EBV檢出序列數均大于3，均診斷為病毒性腦炎［15-16］。其他臨床資料見表1。

表1 30例伴有中樞神經系統癥狀的HPS患兒的臨床資料

2.2 30例患兒血清EBV抗體譜結果

30例患兒VCA-IgG、EBNA-IgG均為陽性，其中2例（7%）VCA-IgM陰性，提示既往感染，為檢測陰性結果；28例（93%）VCA-IgM陽性，提示原發感染晚期或再激活，為檢測陽性結果。3例（10%）患兒VCA-IgG為低親合力抗體，提示原發性急性感染［17］；3例（10%）VCA-IgA陽性，是近期感染、感染再激活或慢性反復持續性感染標志［18］。

2.3 腦脊液mNGS EBV檢測結果

mNGS檢出EBV序列數最高為28 880，最低為43，中位檢出序列數為2 400（420，1.3×104）。檢出序列數40~1×103有10例，1.1×103~1×104有11例，超過1×104有9例。

2.4 腦脊液mNGS與EBV傳統檢測結果比較

腦脊液mNGS EBV檢測陽性率為100%（30/30），腦脊液EBV-DNA定性檢測陽性率為10%（3/30），血清EBV抗體譜檢測陽性率為93%（28/30）。腦脊液mNGS EBV檢測陽性率高于腦脊液EBV-DNA定 性 檢 測 陽 性 率（χ2=49.091，P<0.001），而腦脊液mNGS EBV檢測陽性率與血清EBV抗體譜陽性率比較差異無統計學意義（χ2=0.517，P=0.469）。

將mNGS EBV檢出序列數與患兒年齡、血清鐵蛋白、腦脊液蛋白、腦脊液白細胞數、治療前血清EBV-DNA拷貝數等指標進行相關性分析，發現治療前血清EBV-DNA拷貝數與EBV檢出序列數呈中度正相關（rs=0.693，P<0.001），見表2。

表2 EBV檢出序列數與臨床指標的相關性分析

將以上數據進行多元線性回歸分析，徳賓·沃森值為2.602，共線性方差擴大因子均小于2.5，說明以上參數相互之間獨立。結果顯示，治療前血清EBV-DNA拷貝數越高，腦脊液mNGS EBV檢出序列數越高（P=0.017）。見表3。

表3 多元線性回歸分析結果

2.5 治療前后血清EBV-DNA拷貝數變化

根據mNGS結果，患兒接受阿昔洛韋［10 mg/kg，8 h 1次］抗病毒與地塞米松或甲潑尼龍+足葉乙甙治療。治療前血清EBV-DNA拷貝數中位數為28 050（7 808，1.04×105），針對性治療后患兒血清EBV-DNA拷貝數均下降，中位數為875.0（436.0，1892.5），僅2例 患 兒 治 療 后EBV-DNA拷貝數仍超過6.0×104，該2例患兒治療結局均為死亡。

3 討論

本研究采用mNGS檢測30例伴有中樞神經系統受累的HPS患兒腦脊液，提供HPS患兒顱內EBV感染證據。病毒的分離與鑒定是病毒病原學診斷的金標準，但病毒寄生于活細胞中，分離鑒定困難，并且耗時長。EBV是導致亞洲幼兒HPS的重要因素，HPS病情暴發迅速，進展快，嚴重影響初發或復發患兒預后。早期診斷、提前干預對降低患兒病死率至關重要，但關于HPS顱內EBV感染的研究未見報道。

mNGS作為在兒童危急重癥中應用時間尚短的一門檢測技術，相比血清EBV-DNA拷貝數更能發現顱內受累證據，極大地避免了漏診、誤診，降低患兒病死率的同時提高生存質量。關于抗病毒療程的制定，或將不依賴血清EBV-DNA拷貝數下降指數判定，其陡然下降并非能代表體內全部EBV的有效清除，也需參考腦脊液mNGS EBV檢出序列數情況。腦脊液是一種絕對無菌的體液，腦脊液中病原體載量低，PCR擴增具有偏向性［19-20］，故腦脊液PCR檢測可能引起漏檢，mNGS能更精確地發現HPS患兒顱內EBV感染的證據，為早期干預、制訂更加完善的抗病毒治療方案提供借鑒。

本研究也存在一些局限性，首先，病例數量偏少，患兒年齡差距較大，數據統計未排除因實驗設計帶來的一些偏差；其次，單中心檢測結果有待于多中心研究結果驗證，闡明顱內EBV感染對兒童HPS產生、發展的影響；最后，患兒好轉后未進行腦脊液mNGS復測，后續隨訪數據有待于繼續研究。

綜上，本研究通過mNGS發現EBV在HPS患兒引起顱內感染的證據，并以血清EBV抗體譜、治療前后血清EBV-DNA拷貝數作為參照，證明EBV相關HPS容易誘發EBV感染引起的病毒性腦炎，但有待于多中心更大數據研究驗證。

志謝：感謝迪飛醫學科技（南京）有限公司對本研究的支持。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。