基層非洲豬瘟熒光定量PCR檢測技術研究

文│黃麗非 李桂花 秦桂清（廣西壯族自治區崇左市動物疫病預防控制中心）

2018—2019年，非洲豬瘟病毒導致我國養豬業嚴重虧損，尤其是采用傳統養殖模式的中小型豬場。當豬只感染這種外來病毒時，臨床表現多樣，有急性型、亞急性型、慢性型，該病毒傳染性很強，傳播方式有直接接觸、間接接觸和蜱蟲叮咬。因此，非洲豬瘟在我國被列為一類動物疫病。熒光定量PCR是一種靈敏度高、特異性強、便捷快速的檢測技術。其反應是在PCR反應的基礎上添加含有熒光因子的特異性探針，再利用具有熱穩定性的DNA聚合酶切斷探針，釋放熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，因此熒光信號的強弱代表模版DNA的擴增量。目前我國主要使用該方法檢測非洲豬瘟病毒，該方法也是OIE國際貿易指定試驗方法。

為切實做好非洲豬瘟防控工作，我國正逐步完善基層動物疫病防控基礎設施建設，要求各縣（市、區）建設病原學PCR實驗室，以及各屠宰企業設立非洲豬瘟實驗室，開展非洲豬瘟檢測工作。由于各方面的原因，縣級和屠宰企業非洲豬瘟實驗室條件參差不齊，包括實驗室布局、儀器設備、檢測環境、實驗室檢測人員等方面。廣西壯族自治區崇左市地處邊境與越南接壤，7個縣（市、區）中就有4個邊境縣，非洲豬瘟防控形勢復雜多變，因此，當前非洲豬瘟防控工作的一項重要任務就是規范開展非洲豬瘟熒光定量PCR檢測，提高檢測結果的準確性和可信度。目前，崇左市獲得廣西壯族自治區農業農村廳在授權范圍內開展非洲豬瘟檢測業務的有市級獸醫實驗室1個、縣級獸醫實驗室7個、屠宰企業非洲豬瘟實驗室7個和養殖企業非洲豬瘟實驗室5個，現根據實地調查中發現的問題及實驗室工作經驗，簡單論述如何提高基層非洲豬瘟實驗室熒光定量PCR檢測技術。

一、規范實驗室條件

實驗室存在的主要問題有實驗室功能區設置不合理、人員流向不合理、物品流向不合理、未配備生物安全柜等。建設規范的非洲豬瘟實驗室相匹配的硬件要求主要有以下兩點。

1.實驗室功能分區。設置不少于3個基本的實驗室功能分區，包括樣品處理區、試劑儲存和準備區、擴增和產物分析區。實現各工作區域之間的單向流通，形成單向氣流、物流、人流，避免各區域相互干擾，減少氣溶膠污染。

2.配備必要的儀器設備。為滿足基本熒光PCR檢測，實驗室至少應配備的儀器設備有熒光PCR儀、二級生物安全柜、高壓滅菌器、離心機、水浴鍋、微量移液器、冰箱/冰柜、紫外燈和空調等。各類儀器設備應嚴格按照操作規程進行維護，保證其在規定參數內正常運行。根據職能所需，在基本滿足實驗室儀器設備要求的條件上應有所增加，如配備核酸提取儀、組織破碎儀、低溫離心機、電腦、打印機、洗眼設施、自動水開關等。此外，一些使用頻率比較高的儀器設備如熒光PCR儀可以多購置一套以備不時之需。

二、管控樣品和試劑

1.做好樣品管控。采樣過程應遵循無菌操作原則，選擇合理的采樣方法避免交叉污染，同時做好樣品編號與采樣記錄。全血樣品暫時放4℃冰箱保存，血清樣品放-20℃凍存，PCR檢測用的樣品需盡可能新鮮并低溫保存。所采集的樣品以最快最直接的方式送往實驗室，如果樣品能在24小時內送達，則可以放于4℃左右的容器中運送。樣品送達實驗室后應做好登記，盡快進行檢測，48小時內無法開展檢測或需要留樣的應-20℃冷凍保存。

2.嚴格管控試劑。使用的檢測試劑要符合農業農村部相關要求，按照試劑盒要求妥善保存。試劑存放時溫度偏高不僅容易揮發還導致產品有效活性降低，非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑通常需要保存在-20℃的環境中，并在試劑有效期內使用。如果單次實驗檢測數量較少且不經常檢測時，建議將試劑進行小體積分裝后-20℃存放，因為反復凍融也會導致試劑活性下降。分裝試劑也要遵循無菌操作原則，避開PCR產物擴增區，在潔凈的生物安全柜內使用已滅菌消毒的耗材開展分裝操作，避免試劑被污染。分裝試劑應做好相關標記，如名稱、時間、含量等，方便準確使用。推薦有條件的非洲豬瘟實驗室使用加長帶濾芯的槍頭，可以在一定程度上規避核酸交叉污染的風險。不同試劑廠家生產的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑盒檢測程序與擴增循環會略有不同，應嚴格按照試劑使用說明書的要求進行操作。可以根據不同的對象和要求對檢測樣品進行混樣檢測，但混樣比例不宜過高，容易出現因被檢樣品核酸濃度小于最低檢測限值而出現假陰性的結果。

三、提高檢測技術人員素質

不同機構性質的非洲豬瘟檢測實驗室對檢測技術人員的學歷及人員數量要求有所不同，要求至少具備大學專科以上獸醫相關專業技術人員不少于2名。同時建立人員培訓及考核制度，檢測人員應經過相關法律、法規、實驗室管理制度、實驗室生物安全防護、檢測技術規范、實驗操作技能、儀器設備使用和維護等相關培訓，且考核合格后再上崗。定期對實驗室檢測人員進行考核、培訓和檢測能力比對，也可選擇參加更高級別的實驗室培訓或跟班學習，全面提升檢測人員的檢測技能。

四、強化實驗室管理

1.加強實驗室指導工作。按照相關文件要求，市級、縣級疫控系統獸醫實驗要充分發揮示范帶頭作用，開展非洲豬瘟病毒檢測項目，完善質量手冊、管理手冊有關內容，規范實驗操作流程，做好管理臺賬等各項工作。各檢測室充分利用樣品比對、儀器比對、抽樣復核等檢測實驗，強化、細化實驗室檢測技術員的操作能力，提高檢測精準度，避免因操作不規范而導致的污染和結果偏差。養殖企業及屠宰企業開展非洲豬瘟檢測必須獲得省級部門授權，實驗室條件、設施設備、人員等按文件規定配備，同樣對檢測人員專業素質有要求。省級實驗室應加強對市級、縣級、養殖企業及屠宰企業實驗室的指導、督導和培訓工作，定期開展檢測能力比對實驗，確保轄區范圍內的非洲豬瘟實驗室都能準確、可靠的給出實驗結果。

2.實驗室日常消毒與通風。檢測實驗操作前后都要先對環境進行消毒滅菌，去除環境中可能存在的核酸污染因子。檢測操作前，打開紫外線燈照射整個操作空間20分鐘左右。檢測操作過程中應把使用后的槍頭打入盛有一定量有效消毒劑的燒杯中。檢測操作完成后要及時清理操作臺面，選擇合適的消毒藥品進行清潔，可以是堿類、氯化物、酚化合物等，待環境干燥后再打開紫外線燈照射半個小時。實驗室廢棄物離開實驗室前需經高壓滅菌處理，再進行下一步無害化處理，避免污染環境。很多基層實驗室沒有達到負壓的檢測條件，為減少氣溶膠污染，需要在消毒后定期給實驗室通風換氣。

五、結語

目前用于非洲豬瘟檢測的主要方法是熒光定量PCR、普通PCR法、核酸等溫擴增法、ELSIA法、病毒分離法、熒光抗體法等多種方法，其中熒光定量PCR方法特異性強、靈敏度高，更適合開展快速檢測實驗，因此，在非洲豬瘟診斷和監測工作中普遍使用熒光定量PCR檢測方法。由于部分縣級獸醫實驗室、養殖企業和生豬屠宰企業接觸實驗室病原學檢測比較晚，非洲豬瘟實驗室建設時間較為倉促，易出現實驗室布局不合理、生物安全方面考慮不夠周全等問題，因此，還需進一步加強管理、強化培訓和規范檢測操作，以整體提升非洲豬瘟檢測技術，讓熒光定量PCR檢測方法在非洲豬瘟防控工作中發揮重要的作用。