HBV相關(guān)肝細胞癌的血液生物標志物研究進展*

劉志禮 宜建英 張星鑫 劉樹業(yè)

1 天津市第三中心醫(yī)院檢驗科 300170； 2 天津市第一中心醫(yī)院檢驗科； 3 孝義市人民醫(yī)院檢驗科

據(jù)估計，全世界有20億人感染了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，其中大約2.6億人仍然處于持續(xù)感染[乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性的HBV攜帶者]。每年約有887 000人死于由HBV感染引起的肝硬化和肝癌[1]。大多數(shù)HBV感染患者在肝纖維化進展后發(fā)生肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。HCC的良好候選生物標志物是疾病特異性分子，如HCC細胞釋放到相對容易收集的體液(如血液、唾液等)中的核酸和蛋白質(zhì)。目前，HCC的臨床常用血清生物標志物有甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP) 和維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白(Protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ, PIVKA-Ⅱ)，也稱為脫-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy prothrombin,DCP)。這些血清生物標志物水平升高的患者，可以通過詳細的影像學(xué)檢查或腫瘤組織活檢來確診HCC。如果不考慮成本，使用微創(chuàng)、高性能的生物標志物進行監(jiān)測可以為需要早期篩查HCC的患者提供顯著的臨床益處。生物標志物在識別需要頻繁影像學(xué)監(jiān)測的HCC高危患者方面也有作用。因此，開發(fā)更好的生物標記物和追求生物標記物的性能將直接有助于改善肝癌患者的預(yù)后。除了HCC的腫瘤標志物外，HBV基因型、HBV基因組突變、HBV感染肝細胞的宿主基因組突變以及肝癌細胞的基因表達模式也可以作為HBV相關(guān)性肝癌的候選標志物[2]。基于此，本文總結(jié)了HBV相關(guān)HCC的新型血液生物標志物，特別是聚焦于肝癌發(fā)生過程中HBV基因組和糖基化的標志物。

1 HBV對肝細胞的致癌作用

許多慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)病例會發(fā)展為肝硬化，然后發(fā)展為HCC。HBV慢性感染致癌的分子機制涉及DNA損傷的積累、基因組/表觀遺傳改變、氧化應(yīng)激和細胞衰老。病毒基因組以宿主染色體外共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的形式存在于HBV感染的細胞中。HBV基因組編碼蛋白X(HBV genome encodes protein X, HBx)促進病毒基因組的轉(zhuǎn)錄。在HBV相關(guān)的肝癌組織中經(jīng)常觀察到HBV DNA片段整合到宿主染色體中，整合的DNA經(jīng)常包括HBx基因。HBx基因表達的融合蛋白整合到宿主DNA中，具有反式激活功能，通過該功能激活宿主基因的表達，這被認為是肝癌發(fā)生的原因。

HBV感染一旦發(fā)生，就不能從肝細胞中完全清除。治療的目的是實現(xiàn)所謂的“功能性治愈”，即HBsAg丟失和cccDNA(HBV穩(wěn)定的染色體外轉(zhuǎn)錄模板)的數(shù)量減少。CHB感染的治療方法是注射干擾素(interferons, IFNs)或使用抗病毒藥物核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]進行治療。NAs可以顯著抑制HBV DNA的復(fù)制，因此在治療期間很難檢測血液中HBV DNA水平的變化。血清乙型肝炎核心相關(guān)抗原(Hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)反映肝細胞中cccDNA的數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性，因此是監(jiān)測接受NAs治療的CHB患者的有用指標。

2HBcrAg

HBcrAg由前核心/核心開放閱讀框編碼的三種蛋白組成，即乙型肝炎核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)、22kDa的前核心蛋白和乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)組成。HBcAg蛋白包含在稱為Dane顆粒的傳染性完整病毒體中。除此之外，含有HBcAg、前核心蛋白和HBsAg的空顆粒(無病毒DNA的顆粒)形成并從肝細胞中釋放出來。此外，HBeAg穿過肝細胞膜并分泌到血液中。空顆粒和HBeAg均在與Dane顆粒分離的過程中從肝細胞中釋放出來。即使在抗-HBc或抗-HBe陽性的患者中，HBcrAg檢測也能檢測到抗原，而不用考慮前核心突變，并且HBcrAg水平與血清和肝臟中的HBV DNA水平以及肝臟中的cccDNA水平相關(guān)。HBV DNA檢測已用于臨床實踐，但其成本和較長的檢測時間限制了其在不同地區(qū)的使用。此外，肝內(nèi)cccDNA檢測需要侵入性肝活檢，這使得連續(xù)監(jiān)測變得困難。因此，HBcrAg檢測作為一種可靠、易于使用且成本低廉的檢測方法，在CHB患者管理中的重要性已得到廣泛評估[3]。

在CHB患者中，HBeAg陽性患者的血清HBcrAg水平顯著高于HBeAg陰性患者，并且不僅與血清HBV DNA水平相關(guān)，而且與肝內(nèi)HBV DNA和前基因組RNA相關(guān)，此外還與肝內(nèi)cccDNA水平及其轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)[4]。據(jù)報道，無論HBeAg狀態(tài)如何，與血清HBsAg和HBV RNA相比，血清HBcrAg水平與肝內(nèi)cccDNA水平的關(guān)系更為密切[5]。長期監(jiān)測血清HBcrAg水平適用于NAs治療期間檢測不到HBV DNA的CHB患者，HBcrAg在預(yù)測HBsAg丟失和治療后HBV再激活的風(fēng)險方面可能很有價值。此外，停止NAs治療后血清HBcrAg水平高可預(yù)測1年內(nèi)的病毒學(xué)復(fù)發(fā)[6]。因此，血清HBcrAg被視為考慮停用NAs的有用生物標志物之一。同樣，CHB患者在PEG-IFN治療前和治療期間的血清HBcrAg可能是實現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換和/或HBV DNA抑制的適當(dāng)指標。

CHB患者的血清HBcrAg水平與HCC發(fā)展相關(guān)，并且是CHB患者發(fā)生HCC的獨立預(yù)測因子，低HBsAg/高HBcrAg水平的組合明顯與更頻繁的HCC顯著相關(guān)[7]。此外，HCC患者的高肝內(nèi)cccDNA和血清HBcrAg水平與較差的無復(fù)發(fā)生存率顯著相關(guān)。因此，HBcrAg適用于篩查HBV再激活和HCC發(fā)展風(fēng)險高的CHB患者。最近，Inoue等人證明用于HBcrAg檢測的全自動、高靈敏度的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析比傳統(tǒng)的HBcrAg檢測靈敏度高約10倍，甚至更適用于監(jiān)測cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性和檢測肝炎發(fā)病前的HBV再激活[8]。由于不需要任何特殊技術(shù)，并且能在30min內(nèi)提供結(jié)果，未來有望應(yīng)用于臨床和研究。

總體而言，血清HBcrAg可以預(yù)測臨床結(jié)果，如HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、對治療的反應(yīng)、HBV 再激活和HCC發(fā)展的風(fēng)險。

3 AFP-L3

AFP是由發(fā)育中胎兒的卵黃囊和肝臟大量產(chǎn)生的血清蛋白，它的產(chǎn)量在出生后下降，而在成年人中幾乎沒有。HCC患者血清中AFP水平升高，因此AFP被用作肝臟腫瘤標志物。另一方面，在肝臟炎癥的情況下AFP會隨著肝細胞再生而增加，降低了AFP作為腫瘤標志物的特異性[9]。AFP被認為是由具有高增殖潛能的成熟肝細胞產(chǎn)生的，因為大多數(shù)表達AFP的細胞增殖細胞核抗原呈陽性。

為了解決AFP的特異性問題，研究人員重點研究了AFP的各種糖基化形式的疾病特異性。聚糖是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的第三種生物高聚物，具有由糖苷鍵連接的單糖組成的鏈狀結(jié)構(gòu)。已知聚糖結(jié)構(gòu)具有器官特異性，細胞表面聚糖結(jié)構(gòu)會因組織條件、疾病和細胞轉(zhuǎn)化而改變。對AFP糖基化的分析可以定性評估腫瘤表達的蛋白質(zhì)，而不僅僅是它們的數(shù)量。1981年Breborowicz等人報道了HCC患者血清中AFP糖基化水平的特征性改變[10]。1990年，根據(jù)巖藻糖基化AFP對小扁豆凝集素的親和力，Taketa等人將其分為小扁豆凝集素非反應(yīng)性(L1)、弱反應(yīng)性(L2)和強反應(yīng)性(L3)3種，結(jié)果顯示AFP-L1主要在慢性肝炎和肝硬化中增加，而AFP-L3在HCC中增加[11]。Yamashita 等人報道僅血清AFP-L3即可預(yù)測HCC的預(yù)后[12]。由于HCC的多樣性，AFP、AFP-L3 和PIVKA-Ⅱ這三個標記中哪一個是陽性因病例而異，這種趨勢在早期HCC中尤為明顯。因此，研究人員試圖通過使用三個或其他臨床參數(shù)的互補組合來提高診斷和預(yù)后性能。GALAD評分由五個參數(shù)組成：G(性別)、A(年齡)、L(AFP-L3)、A(AFP)和D(DCP)。GALAD評分是高度客觀的，對于不同國家的HCC檢測具有相似的有用性[13]。BALAD評分和 BALAD2評分是通過將膽紅素和白蛋白水平添加到上述三個腫瘤標志物而創(chuàng)建的指標。BALAD評分可用于預(yù)測HBV相關(guān)肝癌的預(yù)后，BALAD2評分還可以預(yù)測各種病因慢性肝病患者的肝癌預(yù)后。

4M2BPGi

Mac-2結(jié)合蛋白糖基化異構(gòu)體(Mac-2 binding protein glycosylation isomer, M2BPGi)是一種Mac-2結(jié)合蛋白(M2BP)，其表面有一條糖鏈，能夠結(jié)合紫藤花(Wisteria oribunda, WFA)凝集素。M2BPGi 是通過對慢性丙型肝炎患者血清中糖基化的綜合分析確定的，其血清水平與患者纖維化進展之間存在顯著相關(guān)性。顧名思義，M2BP與Mac-2結(jié)合，Mac-2是一種由巨噬細胞和庫普弗細胞表達的半乳糖結(jié)合蛋白。據(jù)報道，乳腺癌、肺癌、胰腺癌和HCC[14]患者血清中的高M2BP水平與不良預(yù)后相關(guān)。M2BP的來源是肝星狀細胞，M2BP在血液中形成環(huán)狀多聚體，其大表面積使其易于糖基化。M2BP位于庫普弗細胞上，M2BPGi的刺激誘導(dǎo)庫普弗細胞表達Mac-2，肝星狀細胞分泌的M2BP可能被庫普弗細胞吸收。因此，M2BPGi 不僅可用作預(yù)測肝纖維化的血清生物標志物，而且還可能通過肝組織細胞外基質(zhì)的炎癥在纖維化的進展中發(fā)揮重要作用[15]。

除了評估慢性肝病的纖維化外，血清M2BPGi水平與HBV感染導(dǎo)致HCC發(fā)展的風(fēng)險顯著相關(guān)。Jun等人報道，M2BPGi在預(yù)測CHB患者發(fā)生HCC方面比AFP更有效[16]。在接受NAs治療的CHB患者和檢測不到HBV DNA的病例中，治療前M2BPGi水平高的患者發(fā)生HCC的風(fēng)險增加[17]。

5 其他生物標志物

上面討論的血液生物標志物的評估已經(jīng)在科學(xué)界達成共識。下面簡要描述一些有望在未來被開發(fā)為HBV相關(guān)肝癌的有希望的血液生物標志物的候選物。

5.1 WFA+-CSF1R 通過對慢性丙型肝炎和肝硬化患者血清的分析，確定了肝癌的另一個聚糖標記物WFA+集落刺激因子1受體(Colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)。CSR1R是一種膜蛋白，其功能與巨噬細胞分化和細胞增殖有關(guān)。據(jù)報道，腫瘤組織中CSF1R的表達與乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)。對慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌患者血清的分析表明，WFA+-CSF1R可能有助于預(yù)測肝癌發(fā)生和肝硬化的預(yù)后[18]。

5.2 細胞外囊泡 細胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由脂質(zhì)雙分子層分隔和糖鏈覆蓋的顆粒，由細胞分泌到體液中。EVs根據(jù)其來源、大小和其他特征，可分為外泌體、微囊泡和凋亡囊泡，但有時很難進行嚴格的區(qū)分。外泌體是在內(nèi)吞過程中形成的囊泡，已知它可以包裹細胞來源的核酸片段，如微小RNA(MicroRNA,miRNA)。外泌體也大量存在于血液中，預(yù)計在液體活檢中很有價值。Matsuura等人分析了從慢性丙型肝炎患者血漿中提取的EVs，發(fā)現(xiàn)miRNA let-7水平與肝纖維化的進展相關(guān)[19]。另一項研究表明與健康受試者相比，從HBV和HCV感染患者血漿中獲得的miRNAs中miRNA-192和miRNA-122的表達降低[20]。對慢性乙型肝病患者血清的分析表明，CHB和肝硬化的HCC患者EVs中幾種miRNAs(miR-21、miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224)的表達顯著高于無HCC的CHB和肝硬化患者[21]。

5.3 細胞游離DNA/循環(huán)腫瘤 DNA血漿中的細胞游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)大多被認為是來自裂解的造血細胞的DNA，而在癌癥患者中，已知部分DNA來源于被免疫系統(tǒng)破壞或凋亡的癌細胞。血液中的細胞外DNA被稱為cfDNA，而源自血液中循環(huán)的孤立腫瘤細胞的DNA被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)。

Qu等評估了使用HBsAg陽性、無癥狀個體血液中具有體細胞突變的cfDNA篩查早期 HCC的能力[22]。從血液中提取cfDNA并檢測以下基因中至少一個是否存在突變：TP53、TERT、CTNNB1、AXIN1和CTNNB1。此外，HBV整合也被選為檢測cfDNA的基因組畸變。在通過血清AFP水平或腹部超聲篩查HCC時檢測為陰性的患者中，敏感性(cfDNA檢測為陽性且腹部增強CT檢測到HCC的患者百分比)為100%，特異性為94%。另一項研究表明，血漿總cfDNA水平可作為預(yù)測HCC切除后患者HBV相關(guān)HCC早期復(fù)發(fā)的生物標志物[23]。

6 小結(jié)

本文中，根據(jù)與腫瘤發(fā)病機制相關(guān)的HBV 基因組特征和細胞糖基化蛋白的分子機制，描述了HBV相關(guān)HCC中基于血液的生物標志物的現(xiàn)狀。HBcrAg水平反映了HCC的風(fēng)險，可用于監(jiān)測HCC的再激活。AFP-L3水平有助于篩選和確定肝癌發(fā)生的預(yù)后。M2BPGi檢測有助于預(yù)測肝纖維化和肝癌的發(fā)展。所有這些生物標志物都已用于臨床實踐，并且都提供了可以從患者血液中獲得的信息。

新技術(shù)(包括糖基化綜合分析、細胞外囊泡分析和cfDNA/ctDNA分析)有望作為具有更高敏感性和特異性的候選血液生物標志物在不久的將來得到實際應(yīng)用。自從1964年Blumberg等人發(fā)現(xiàn)HBV作為“澳大利亞抗原”以來，許多研究者的積極研究大大提高了HBV相關(guān)HCC的診斷和治療技術(shù)。另一方面，全球HBV感染患者的數(shù)量一直在增加，為了減少HBV相關(guān)的肝硬化和HCC，需要在基于血液的生物標記物的開發(fā)方面取得進一步進展。