外泌體對缺血性卒中的作用機制及研究進展

張冬雪，鄒偉

卒中是全球公共健康的高危疾病之一，具有高發病率、高死亡率、高致殘率等特點，據統計，全球每年新增卒中患者約1500萬，是世界第2大致死和第3大致殘疾病。其中缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是卒中的主要亞型，主要由腦大動脈閉塞導致的局灶性腦缺血引起，占所有卒中的80%左右[1-2]。對于IS的治療，及時的血液再灌注，包括使用tPA進行超早期靜脈溶栓或手術機械取栓治療，是最直接有效的療法[3]。但相關研究顯示，tPA在血管內的溶栓作用是有益的，在腦實質內（非溶栓作用）是有害的，且tPA治療時間窗窄，僅有4.5 h，禁忌證較多，治療后有發生腦出血的風險，多數患者因錯過最佳治療時機，出現不同程度的后遺癥[4]。找到高效又安全的療法成為IS研究亟待解決的問題。近年來，外泌體因其獨特的細胞間交流、靶向運輸、內容物加工等特性受到廣泛關注[5]，且外泌體內的微小核糖核酸（microRNA，miRNA/miR）作為IS的新型標志物，可促進血管生成和神經發生，抑制炎癥反應和細胞凋亡。深入研究外泌體對IS后繼發性神經損傷的作用有助于該病的早期診斷、治療及預后[6-7]。本文主要介紹外泌體對IS的作用機制、防治價值以及干細胞源性外泌體的相關治療作用，以期為該病的治療和科學研究提供借鑒。

1 外泌體概述

外泌體是一種直徑為30～150 nm的特殊細胞外囊泡[8]，1983年被首次發現[9]，1987年被正式命名為“外泌體”[10]。在研究初期，人們發現外泌體可清除細胞內某些無用的RNA片段與質膜，尤其在中樞神經系統中，外泌體充當細胞“清潔工”角色，用于給細胞減負[11]。近年來研究發現，在一定條件下，外泌體可運載蛋白質、膽固醇、DNA、RNA（mRNA、非編碼RNA、miRNA）等物質，并通過質膜融合和受體-配體識別完成細胞間信號交流與傳導[12]。尤其是其所含的RNA，對受體細胞有重要的調控作用[13]，其中miRNA是一類高度保守的內源性非編碼小RNA，通過與靶mRNA的3’-非翻譯區（3’-UTR）結合來阻斷mRNA的轉錄，增加mRNA穩定性，抑制翻譯和表觀遺傳變化，進而調控基因表達[14]。同時外泌體可將miRNA分子遠距離平移轉載至受體細胞，實現了細胞間高效信息交流和靶向運輸[15]。此外，外泌體小而無毒，其外膜為脂質層結構，可以很容易地穿過血腦屏障而不引起免疫反應[16]，而不同源細胞的外泌體表面都攜有特殊蛋白（如CD9、CD63）、熱休克蛋白、參與膜融合與運輸的蛋白（如GTP酶、附件蛋白）和凋亡誘導因子相互作用蛋白（apoptosis inducing factor interacting protein X，Alix）、腫瘤易感基因101（tumor suppressor gene 101，tsg101）等相似的保守蛋白，外膜富含神經酰胺和甘油磷脂，提高了對靶細胞的親和性，便于被識別和分離純化，也保證了外泌體廣泛存在于生物體體液中不被降解，發揮穩定性作用[17]。正是這些特性，為外泌體治療神經系統疾病提供了有力的基礎理論支撐，使其成為介導腦損傷后特異性生物標志、靶向藥物運輸和神經元再生的理想選擇，為外泌體治療IS的進一步研究和臨床應用提供了可能[18]。

2 外泌體與缺血性卒中

IS是臨床最常見的腦血管病之一，其繼發的腦損傷機制極為復雜，但多與缺血灶擴張導致炎癥反應、神經元壞死、血管損傷和細胞凋亡等機制有關。研究證實，外泌體作為細胞間物質和信息的“傳遞員”，參與調控各種生理、病理過程，并可通過抑制以上損傷，延緩病理進程[6-7]。此外，在不同病理狀態下細胞分泌的外泌體有各自的特征性作用，當腦組織缺血缺氧時，多個miRNA表達水平均發生變化，并在不同區域和時間上差異明顯，可利用這些差異對比，尋找生物標志物，發掘外泌體對IS的防治價值[19]。

2.1 外泌體對缺血性卒中的作用機制

2.1.1 抑制炎癥反應 免疫炎癥反應是導致卒中后繼發性腦損傷的重要原因之一。其中小膠質細胞是先天免疫系統的主要組成部分，是中樞神經系統中重要的固有免疫細胞，被認為是對急性腦損傷（包括腦梗死）做出反應的第1個非神經細胞[20]。急性腦損傷后，炎癥反應立即觸發，小膠質細胞被過度活化并表現為M1（促炎）和M2（抗炎）兩種類型[21]。因而調控小膠質細胞的極化可作為抑制IS后腦損傷的治療靶點。研究發現，小鼠腦損傷后，損傷區域內星形膠質細胞外泌體miR-873a-5p表達增加，介導細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF-kB）信號通路和小膠質細胞的M1活化被抑制，促進M2型標志物精氨酸酶1（arginase 1，ARG1）、IL-4、IL-10表達，增強抗炎作用[22]。黃山[23]發現，小鼠重復創傷性腦損傷（repetitive traumatic brain injury，rTBI）后，小膠質細胞外泌體miRNA-124-3p表達增加，調節哺乳動物雷帕霉素靶蛋白-蛋白激酶B（mammalian target of rapamycin-protein kinase B，mTORAkt）信號通路，促進小膠質細胞從M1型向M2型極化的轉變，抑制rTBI后的神經炎癥反應。同時M2型小膠質細胞外泌體miR-124被神經元吸收，抑制其下游泛素特異性蛋白酶14（ubiquitin-specific protease 14，USP14）表達，降低實驗小鼠的腦梗死面積，促進神經功能恢復[24]。

2.1.2 促進神經元再生與突觸重塑 由于腦組織對缺血缺氧的耐受性極差，當腦血管破裂或相應供血動脈阻塞后，大腦神經元很快發生不可逆性損傷甚至壞死。研究表明外泌體miRNA可調控神經軸突的增殖和分化，促進神經元再生與突觸重塑[25-26]。Meng等[25]通過雙熒光素酶報告分析證實，細胞癌基因c-Fos為miR-181c的靶基因，IS后外泌體miR-181c表達下調，c-Fos基因表達增加，同時激活活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和活化T細胞核因子c1（nuclear factor of activated T-cells cytplasmic 1，NFATc1）等下游基因，提高腦組織對缺血缺氧損傷的耐受性，進而保護神經元細胞。在體外實驗中，E盒結合鋅指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2，Zeb2）/軸抑制蛋白（axis inhibition protein 2，Axin2）可刺激內源性神經發生，誘導卒中后神經功能恢復，在大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中，富含Zeb2/Axin2的外泌體可下調性別決定區盒基因10（sex determining region Y-box 10，SOX10）、內皮素-3和Wnt/β-連環蛋白（Wnt/β-catenin）表達，增強神經干細胞的增殖和分化，促進腦室下區、海馬區、皮質區神經元再生以及神經生長因子表達上調，改善MCAO大鼠神經可塑性，而在缺血邊界區，富含Zeb2/Axin2的外泌體可逆轉缺血損傷引起的軸突缺失，促進突觸重塑和增殖[26]。

2.1.3 促進血管新生 IS發生后，局部血供破壞，腦組織缺血乏氧，導致血管通透性改變等一系列連鎖反應，加重腦組織損傷。內皮細胞來源于內皮祖細胞，是構成血管系統的基本單位，內皮細胞的增殖和分化是血管生成的重要環節。研究發現，大鼠腦梗死模型建立12 h后，梗死區域內內皮細胞開始增殖，3 d后缺血半暗帶區域血管密度增加，循環內皮祖細胞釋放的外泌體miR-296轉移到受體內皮細胞，促進血管生成[27-28]。此外，內皮細胞外泌體miR-210是促進血管生成和神經生成的關鍵因子，與局部血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平升高相關，miR-210的上調是內皮細胞對缺氧反應的關鍵反饋，可直接影響內皮細胞生存、遷移和分化[29]。實驗證實，在缺氧條件下，miR-210表達增加，促進內皮細胞增殖和血管新生，提示miR-210可能是IS治療的潛在靶點[30]。而在大鼠創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）模型中，miR-17-92富集的外泌體可顯著改善大鼠感覺、運動功能，促進內源性血管新生[31]。

2.1.4 抑制細胞凋亡 研究表明，細胞凋亡廣泛參與IS的發病機制，來自不同細胞的外泌體可抑制缺血模型中的細胞凋亡和神經元死亡，在IS病程中具有明顯的神經保護潛能[32]。Deng等[33]發現，中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白2（lipocalin 2，LCN2）表達增高可介導神經元死亡和腦損傷，而外泌體miR-138-5p是LCN2的負調控因子，在氧-葡萄糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）誘導的星形膠質細胞中，過表達的miR-138-5p可通過抑制LCN2表達下調半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate protease 3，caspase-3）和B細胞淋巴瘤/白血病2基因相關X蛋白（B cell lymphoma/leukemia 2 gene associated X protein，Bax）的水平，上調Bcl-2水平，抑制星形膠質細胞的凋亡，減少缺血后的神經元損傷。此外，在缺血模型中，外泌體miR-22-3p能結合并抑制賴氨酸特異性去甲基化酶6B（lysine-specific demethylase 6B，KDM6B）表達，并通過KDM6B/骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）/Bcl-2修飾因子（Bcl-2 modifying factor，BMF）軸發揮抗凋亡作用[34]。內皮細胞來源的外泌體可抑制caspase-3、Bax的表達水平，上調Bcl-2的表達水平，保護神經細胞免受缺血再灌注損傷[35]。

2.2 外泌體對缺血性卒中的防治價值

2.2.1 早期診斷 臨床過程中，在卒中溶栓時間窗內區分TIA和IS極為困難，早期診斷對疾病的治療和預后尤為重要。Ji等[36]發現，急性期IS患者血清外泌體miR-9和miR-12水平明顯高于健康人，且與卒中評分和血清IL-6含量呈正相關，其相關系數分別為0.7126、0.6825和0.6980、0.6550，提示外泌體miR-9和miR-12是急性期IS診斷和嚴重程度評估的潛在標志物。Li等[37]檢測不同缺血時長大鼠腦脊液和血漿中趨勢一致的外泌體miRNA含量，結果顯示，缺血10 min大鼠血漿外泌體rno-miR-122-5p水平較其他組明顯下調，缺血5 min大鼠血漿外泌體rno-miR-300-3p水平顯著高于其余各組，且血漿和腦脊液中這些miRNA的水平是相關的，提示外泌體rno-miR-122-5p和rno-miR-300-3p可能是TIA血源性的生物標志物。除此之外，血漿miR-21-5p、miR-30a-5p和miR-223等對IS的診斷也有重要價值[38-39]。

2.2.2 臨床分期 Li等[40]采用反轉錄聚合酶鏈反應（reverse trans-criptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測55例IS患者和25名健康對照者血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p的水平，通過構建ROC曲線評估miR在IS分期中的診斷準確性，結果顯示，與健康對照組相比較時，亞急性期兩種miRNA的AUC分別為0.971和0.889；急性期AUC分別為0.769和0.423；在急性期與亞急性期表達比較時，miR-422a的AUC為0.957，miR-125b-2-3p的AUC為0.769。可見血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p可作為IS患者的血液生物標志物，其中miR-422a的診斷價值更高，這兩種miRNA的聯合使用可能是確定急性與亞急性IS分期的有力手段。

2.2.3 靶向治療 研究顯示，基因靶向治療是治療IS的理想療法，外泌體含有源代細胞的特異性miRNA，是體內基因靶向運輸的天然載體[41]。Gherardini等[42]發現，卒中后星形膠質細胞增生產生的硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sul-fate proteoglycan，CSPG）可抑制神經元軸突再生。在MCAO大鼠模型中，皮質神經元miR-17-92過表達簇富集的外泌體可靶向抑制磷酸酶和張力素同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因的表達，增加PTEN下游蛋白的磷酸化，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進皮質神經元軸突生長與缺血邊界區的神經突觸重塑，改善神經功能，克服了CSPG的抑制作用[43]。在小鼠腦缺血再灌注實驗中，外泌體miR-451a可以靶向抑制Ras相關的C3肉毒素底物1（Ras related c3 botulinum toxin substrate 1，Rac1），減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，提高缺血再灌注后神經細胞的存活率[44]。

2.2.4 預后評估 Wang等[45]通過臨床高通量測序篩選分析卒中患者血清外泌體中的獨特miRNA，發現miR-328-3p上調時會加重腦缺血再灌注損傷，證明miR-328-3p對IS的短期預后具有重要的預測作用。在急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者血液中，外泌體miR-134表達量顯著高于健康對照組，且高表達的外泌體miR-134水平與患者NIHSS評分、梗死體積、IL-6和血漿hs-CRP含量呈正相關，其相關系數分別為0.6079、0.7841、0.6936和0.6207，在預后較差的卒中患者中miR-134峰度較高（mRS＞2分），提示外泌體miR-134可能是區分AIS與非卒中的關鍵因素，是評估AIS預后的新型標志物[46]。

3 干細胞源性外泌體對缺血性卒中的治療作用

近年來，干細胞移植治療IS取得了較好的效果[47]，最初的目的是用干細胞替換丟失或損傷的組織，經過不斷深入研究發現，干細胞可通過分泌外泌體促進受損腦組織重塑和血管新生，恢復神經功能，而無須考慮干細胞移植可能帶來的免疫排異反應等不良反應。其中，間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）源性與神經干細胞（neural stem cells，NSC）源性外泌體研究最為廣泛。

3.1 間充質干細胞源性外泌體 目前已知可分泌外泌體的細胞類型中，MSC是最高產的一類細胞，在動物疾病模型中，MSC源性外泌體（MSC-exos）具有治療作用并表現出免疫抑制活性，且其質量和數量不會因MSC永生化而打折扣[48]。研究表明，MSC移植作為IS的輔助治療方法，其作用僅次于溶栓治療[49]，然而MSC并沒有被整合到原有的神經網絡中，而是通過釋放外泌體間接改善腦神經損傷，誘導神經再生。Shabbir等[50]發現，內化的MSC-exos可促進成纖維細胞增殖和遷移，誘導血管內皮細胞管狀分化，同時激活Akt、ERK和信號轉導與轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等多條信號通路，誘導多種生長因子（如神經生長因子）表達增加，促進血管愈合與新生，且內皮細胞和新生血管數量與MSC-exos的濃度有明顯的劑量依賴性，進一步證實MSC-exos在IS治療中的重要作用。

3.2 神經干細胞源性外泌體 既往研究證實，NSC是僅存在于神經系統的特殊類型的干細胞，可塑性極強，可直接分化為神經元，具有補償內源性神經細胞不足和改善細胞生存炎癥微環境的能力[51]。基于旁觀者效應（如神經保護、免疫調節），NSC源性外泌體（NSC-exos）可克服細胞移植治療中的免疫反應或排異等風險，被成功內吞入細胞內[52]，減少大鼠神經元凋亡，抑制小膠質細胞激活和神經炎癥[53]。因此，作為神經系統的天然種子資源，且NSC的無細胞治療是一種新的治療策略，NSC-exos在IS治療中發揮著重要作用[54]。研究表明，NSC-exos含有與神經再生、神經保護和神經可塑性相關的miRNA和蛋白，并可作為獨立的代謝單位，改變環境中關鍵營養物質的濃度，影響周圍細胞的生理功能，抑制IS后腦組織水腫，保持腦白質的完整性[55]。同時NSC還可以被干擾素γ正向誘導，產生變異外泌體，增強NSC-exos促細胞增殖和抗凋亡作用，突出了NSC-exos的重要作用和巨大前景[56]。

4 不足與展望

當前，改善腦組織的缺血再灌注損傷仍然是IS治療的重點和難點，外泌體能夠穿越血腦屏障，且自身結構穩定，耐受性強，具有攜帶、運輸特異性“貨物”，完成細胞間信息傳遞和靶向運輸的作用，啟發了外泌體載藥療法的發展，推動了IS治療方法的多樣化。但外泌體研究尚處于初級階段，仍有不足之處：①在現有的外泌體治療IS的研究中，多以觀察性實驗為主，如何調控外泌體的釋放和內容物的“分揀”，以及外泌體在大腦中的遷移和歸巢能力仍未被研究。②由于外泌體體積極小、定量方式不一，難以進行嚴格的分離、純化和計算給藥劑量。③臨床中靶向能力不足、體內半衰期短、有效載荷不足等弊端也限制了外泌體載藥療法的應用。④是否有哪些因子或通路在卒中后介導或激發相關細胞釋放外泌體，以及如何誘導、修飾外泌體，增強其正向作用，仍然是外泌體研究的熱點。因此，在接下來的研究中，應在現有的理論和機制研究基礎上，針對以上問題進行深入探索與研究。

綜上所述，外泌體通過參與IS的病理過程發揮作用，是調節IS后繼發性腦損傷的重要環節。雖然目前外泌體在IS領域的相關研究還不完善，但其發現對于提高IS后神經細胞存活率和改善患者預后具有重要作用。進一步探討外泌體的作用與轉歸，探析其治療靶點及調控機制，對于防治IS后繼發性神經功能損傷具有長遠的臨床意義。

【點睛】腦組織缺血再灌注損傷是IS治療的重點和難點，外泌體及其內含的microRNA作為IS的新型標志物，可促進血管生成和神經發生，抑制炎癥反應與細胞凋亡，對IS的早期診斷、治療及預后具有積極作用。