基于聲表面波-氣相色譜聯用技術快速分析麝香中的麝香酮*

陸艷艷 沈剛 王劍波 朱宏偉 趙軍寧? 郝俊杰 何世堂?

(1 中國科學院聲學研究所北京 100190）

(2 四川省中醫藥科學院成都 610041）

0 引言

麝香是一味沿用至今的稀貴中藥材，為鹿科馬麝、林麝或原麝雄體香囊中的干燥分泌物。麝香含有大環化合物如麝香酮、甾族化合物(雌二醇、膽甾醇)等。麝香酮是麝香的主要有效成分之一，具有開竅醒神、活血通經、消腫止痛等功效，且具有雙向調節中樞神經系統、抗炎、強心、抑制腫瘤細胞，對缺血性心臟障礙有預防和治療的作用[1-2]。

麝香中麝香酮常用的檢測方法有高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜法(Gas chromatography,GC)、紫外-可見分光光度法(Ultraviolet and visible spectrophotometry,UV)等[3-4]，然而這些方法的檢測儀器體積過于龐大，且分析時間較長，一般需要30 min以上，只適用于實驗室分析，無法滿足現場快檢(Point-of-care testing,POCT)需求。

聲表面波(Surface acoustic wave,SAW)傳感器作為一種聲-電換能器，能夠在很小的叉指換能器中實現。傳感器由兩個基本相同的SAW器件與對應的振蕩電路構成。一路振蕩器與氣相色譜結合，使用精密溫控來吸附待測氣體，作為測試回路；另一路振蕩器則作為參考基準，計算差頻后可最大程度上消除外圍環境如振動、溫度等對于振蕩器頻率穩定性的影響。聲表面波傳感器面積僅12 mm2，因此檢測器體積相對較小[5-6]。

本實驗使用中國科學院聲學研究所與四川省中醫藥科學院聯合研制的氣相色譜-聲表面波(GCSAW)聯用技術對麝香進行快速檢測，其具體的原理框圖見圖1[5]。在采集階段，麝香樣品通過采樣泵進入預濃縮管，在預濃縮管麝香樣品揮發性成分被吸收；在進樣分析階段，切換六通閥，載氣瓶中的氮氣把預濃縮管(溫度升高至250°C)中采集到的樣品帶入色譜柱。化合物進入色譜柱，色譜柱只有1 m長，采用柱上升溫系統，使得色譜柱升溫速率較快，達到10°C/s。不同化合物在色譜柱分離效果會不一樣，其到達檢測器的時間也會不同，根據化合物出峰時間進行定性分析；不同質量的化合物會引起檢測器頻率發生改變，根據檢測器頻率的變化量可對物質進行定量分析。

圖1 聲表面波氣相色譜儀原理框圖[5]Fig.1 Principle block diagram of SAW gas chromatograph[5]

利用GC-SAW聯用技術對麝香易揮發性成分進行定性、定量分析，具有分析操作簡便、體積小、分析速度快等特點，可實現化合物的廣譜(揮發和半揮發性有機物)、高靈敏度(10-12級)、快速(＜5 min)分析[5]，適合于現場分析。目前GC-SAW在水質監測、環境、精油等方面體現了較好的應用優勢[7-9]，但在中藥麝香酮含量的檢測還未涉及。本文研究了GC-SAW在中藥麝香檢測中的方法學應用，為中藥麝香中麝香酮的現場快速定量分析提供一種新的快捷的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 實驗耗材與設備

聲表面波氣相色譜儀：中國科學院聲學研究所(諧振型聲表面波傳感器，基頻500 MHz；色譜柱DB-5(1 m×0.18 mm×0.25 μm))。恒溫加熱器：廈門宇電科技有限公司。

高純氮氣(99.999%)：北京兆格氣體科技有限公司。乙醇(≥99.5%)：TEDIA。麝香酮標準溶液(100 mg/mL)，國家標準物質研究中心。S1-S16麝香樣品：由四川省中醫藥科學院方清茂研究員鑒定為中藥麝香正品。

1.2 實驗方法

1.2.1 麝香酮標準品的配制

標準品配制：取質量濃度為100 mg/mL的麝香酮標準品，經過逐級稀釋，分別配制含量為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL和3.2 μg/mL的麝香酮標準溶液。

1.2.2 樣品的前處理

樣品前處理：取干燥的麝香樣品20 mg放入試劑瓶中，加入5 mL無水乙醇，超聲30 min后，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到濾液，取20 μL于2 mL無水乙醇中，得到待測樣品。

2 結果與討論

2.1 色譜條件與系統適應性實驗

色譜條件：DB-5色譜柱，初始溫度45°C，按10°C/s程序升溫至180°C。進樣口溫度為200°C；檢測器溫度為40°C；六通閥溫度為160°C；載氣為99.999%純度的氮氣，3 mL/min；泵吸時間為10 s；分析時間為20 s[10-11]。1.6 μg/mL麝香酮標準溶液進樣0.1 μL，如圖2所示，麝香酮保留時間為6.62 s，峰形較好，在20 s時間內可達到良好的分離效果。

圖2 1.6 μg/mL麝香酮標準溶液測試色譜圖Fig.2 Test chromatogram of 1.6 μg/mL muscone standard solution

2.2 標準曲線與檢出限

取含量為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL和10 μg/mL的麝香酮標準溶液，在2.1節的色譜條件下分別測試3次，以麝香酮的質量濃度對其響應值(峰面積)均值繪制標準曲線。線性回歸曲線方程為y=1830.3x+364.88，相關系數R=0.9976，在0.2～10 μg/mL范圍內呈良好的線性關系(圖3)。

圖3 GC-SAW中不同質量濃度麝香酮的響應標準曲線(n=3)Fig.3 Response standard curves of musk with different concentrations in GC-SAW(n=3)

依據校準曲線的偏差和斜率方法計算麝香酮檢測限和定量限，根據已知標準曲線已知質量濃度的響應值，使用Excel中的Linest函數和檢出限公式如下：檢測限DL=3.3σ/S；定量限QL=10σ/S，其中，σ為標準偏差；S為斜率。計算得到麝香酮檢出限為0.158 μg/mL，進樣量為0.1 μL，即檢出限絕對質量為15.8 pg。計算麝香酮定量限為0.478 μg/mL，進樣量為0.1 μL，即定量限絕對質量為47.8 pg。

2.3 精密度實驗

對0.2 μg/mL、0.8 μg/mL、3.2 μg/mL三種質量濃度的麝香酮標準溶液分別連續測定6次，計算相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)分別為3.24%、3.09%和2.89%(見表1)。測試結果表明該方法的精密度良好。

表1 不同質量濃度麝香酮標液精密度測試數據(n=6)Table 1 Precision test data of different concentrations of muscone standard solution(n=6)

2.4 重復性實驗

取配制好的質量濃度為0.8 μg/mL和3.2 μg/mL麝香酮標準溶液各6瓶，每瓶測定3次取平均值，計算組間的相對標準偏差RSD值，測試結果見表2。測試麝香酮重復性RSD值為4.23%以內，表明該方法的重復性較好。

表2 麝香酮溶液重復性測試數據(n=3)Table 2 Repeatability test data of muscone solution(n=3)

2.5 穩定性試驗

取配制好的質量濃度為0.8 μg/mL的麝香酮溶液，放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后分別測定其響應，每瓶測定3次取平均值，表3結果顯示，其RSD值為4.49%以內，表明該溶液在24 h內穩定。

表3 麝香酮甲液穩定性測試數據(n=3)Table 3 Stability test data of muscone solution(n=3)

2.6 加樣回收率實驗

1號干燥麝香樣品取6份，每份約10 mg，分別置于試劑瓶中，各加入100 mg/mL麝香酮標準品溶液3.5 μL，再加入無水乙醇5 mL，超聲30 min后，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到濾液，取20 μL混入2 mL無水乙醇中，得到待測樣品。進樣0.1 μL測試，每瓶測定3次，取平均值計算回收率，結果如表4所示，平均回收率為98.64%，RSD為4.53 %。

表4 不同質量濃度麝香酮標液加樣回收率測試數據Table 4 Recovery rate test data of muscone standard solution with different concentrations

2.7 中藥麝香樣品測試

根據2.1節的測試條件，測試16組不同產地、不同年齡段和不同品種的麝香樣品，每組測試3次，1號麝香樣品測試結果如圖4所示，16組麝香樣品中麝香酮的含量如表5所示。

表5 16組樣品中麝香酮含量測試結果(n=3)Table 5 Test results of muscone content in 16 groups samples(n=3)

圖4 1號麝香樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of No.1 musk sample

測試16組不同產地、不同品種、不同年齡段的麝香樣品，其麝香酮含量在2.10%～3.84%范圍內，含量均高于藥典要求的2%。從測試結果分析，不同產地、不同品種、不同年齡段的麝香酮含量差異較大。四川圭興林麝中麝香酮含量最高，且三年生林麝麝香酮含量高于一年生林麝，一年生林麝麝香酮含量為3.45%，三年生麝香酮含量為3.84%。陜西鳳縣一年生林麝的麝香酮含量最低，為2.10%。三年生的林麝和馬麝中麝香酮含量均大于一年生，說明麝香生長年份越長，麝香酮含量越高。不同產地、不同年齡段的馬麝和林麝麝香酮含量差異不明顯。

3 結論

本實驗應用GC-SAW聯用技術對麝香中主要成分麝香酮探索性地進行檢測，采用柱上升溫系統，7 s內可檢出麝香酮。使用GC-SAW聯用技術實現了對麝香酮定性、定量檢測，且具有較好的響應特性、精密度、重復性和穩定性。本文通過液體進樣對麝香酮進行定量分析，定量測定在0.2～10 μg/mL范圍內有較好的線性，麝香酮的最低檢出限為15.8 pg。測試16組麝香樣品，麝香酮含量最高的為四川圭興林麝，含量最低的為陜西鳳縣林麝，三年生的麝香酮含量均大于一年生，與中草藥報道的爵香產量從麝一歲到三歲半呈遞增速度相符合[12-13]。麝香酮作為麝香質量的控制指標之一，采用GC-SAW對麝香中主要成分麝香酮進行定量分析，可用于指導中藥麝香質量評價。

本文分析GC-SAW在檢測麝香酮定量分析的潛在應用，為中藥麝香現場檢測快檢提供一種新的分析技術。在此研究的基礎上與中國藥典方法進行比較，中國藥典中使用傳統氣相色譜法測試麝香酮含量，測試一個樣品需要30 min以上，取樣量需要為200 mg，而GC-SAW分析方法可在幾十秒內可實現快速檢測，取樣量只需要20 mg，在皮克級、納克級顯示出良好的靈敏度。因此，GC-SAW新方法有望作為分析中藥麝香的替代分析技術，提供簡單、快速、高靈敏度的分析方法。