非洲豬瘟病毒的不同病原學(xué)檢測方法比較

付玉亮

（山東省臨沂市蘭陵縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東臨沂 277700）

非洲豬瘟最早起源于非洲，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織要求必須上報(bào)的傳染病之一。自1921年以來，非洲豬瘟病毒在撒哈拉以南非洲國家和撒丁島肆虐，該病的流行對養(yǎng)豬業(yè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大影響。后來疫情陸續(xù)蔓延至歐洲、南美洲、歐亞交界等地，后又傳入俄羅斯、烏克蘭、波蘭、意大利等國家，2014年立陶宛和波蘭報(bào)道非洲豬瘟感染野豬的病例。2017年非洲豬瘟病毒在羅馬尼亞和捷克共和國流行，2018年在保加利亞、匈牙利、比利時(shí)流行，同時(shí)，2018年8月我國也發(fā)生非洲豬瘟疫情。

從世界各國對非洲豬瘟的防控經(jīng)驗(yàn)來看，目前該病只能通過流行病學(xué)監(jiān)測、撲殺、無害化處理等措施處理，同時(shí)，需要提高生豬調(diào)運(yùn)監(jiān)管、生物安全措施，嚴(yán)格檢疫等。不管是在生豬飼養(yǎng)環(huán)節(jié)，還是在生豬屠宰環(huán)節(jié)，監(jiān)測預(yù)警尤為重要，是進(jìn)行緊急處置的前提，要想做到“早、快、嚴(yán)、小”（即早發(fā)現(xiàn)、快處理、嚴(yán)格執(zhí)行防控措施、損失最小）的處置原則，必須進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的非洲豬瘟病毒診斷。

目前市場上已有多種可用的針對非洲豬瘟病毒的診斷試劑和診斷方法。常用的檢測方法包括普通PCR、熒光定量PCR、LAMP等。2018年底、2019年初，中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心組織開展了第一次、第二次非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測試劑評價(jià)工作，對熒光定量PCR類、等溫?cái)U(kuò)增類、試紙條類檢測試劑進(jìn)行了比對評價(jià)，有26家生產(chǎn)商共30余個(gè)檢測試劑產(chǎn)品可用于非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測。本文對不同的非洲豬瘟病原學(xué)檢測方法進(jìn)行簡單闡述，分析不同方法之間的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為準(zhǔn)確診斷及監(jiān)測非洲豬瘟病毒提供參考。

1 非洲豬瘟在我國的流行概況

非洲豬瘟病原為非洲豬瘟病毒（ASFV），ASFV為大型雙鏈DNA病毒，具有包膜。根據(jù)非洲豬瘟病毒編碼衣殼蛋白p72的B646L基因可將非洲豬瘟病毒分為24種基因型[1]。病毒基因組在170至193 kbp間變化，編碼150～167種蛋白。非洲豬瘟病毒感染家豬和野豬，鈍緣軟蜱是該病毒的生物媒介，可以長期感染帶毒，并成為重要的傳染源，類似于病毒庫。

非洲豬瘟病毒主要通過接觸傳播，易感動(dòng)物接觸染疫動(dòng)物或被病毒污染的飼料、水、環(huán)境等可造成感染，有氣溶膠短距離傳播的可能。此外，人類活動(dòng)是造成非洲豬瘟病毒傳播的重要因素，生豬調(diào)運(yùn)、豬肉加工運(yùn)輸?shù)瓤稍斐稍摬《究焖佟⑦h(yuǎn)距離傳播。

非洲豬瘟的臨床癥狀與很多疾病相似，加上低毒力毒株的流行，發(fā)病后的生豬沒有典型癥狀，很容易與其他疾病混淆，這導(dǎo)致早期診斷困難，甚至在采取疫病控制措施之前病毒可能已經(jīng)蔓延。

2018年8月，我國遼寧首次出現(xiàn)了非洲豬瘟疫情。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第一時(shí)間啟動(dòng)應(yīng)急響應(yīng)，對發(fā)病豬群進(jìn)行了處理，雖然采取了撲殺、無害化處理等合理的綜合防控措施，但疫情仍然迅速向全國各地蔓延，且傳播速度很快。截至2018年12月31日，我國共報(bào)告家豬疫情97起，野豬疫情2起；2019年發(fā)生家豬疫情60起、野豬疫情3起；2020年發(fā)生家豬疫情18起、野豬疫情1起，2021年截至12月1日，發(fā)生家豬疫情14起。2018年發(fā)生的多起非洲豬瘟疫情與泔水飼喂、人員和車輛的流動(dòng)有關(guān)，2019年、2020年生豬調(diào)運(yùn)引發(fā)的疫情略有上升。

2 非洲豬瘟病毒的分離

非洲豬瘟病毒分離鑒定主要采用紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)。20世紀(jì)60年代Malmquist、Hay發(fā)現(xiàn)豬感染非洲豬瘟病毒的白細(xì)胞可以吸附紅細(xì)胞，并于吸附后48 h裂解；而豬的其他任何病毒都不具有這個(gè)特性。因此該檢測方法具有較高的特異性，時(shí)至今日仍是非洲豬瘟病毒檢測的重要病原學(xué)檢測方法。

3 病原快速檢測方法

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）從20世紀(jì)90年代開始快速發(fā)展，目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是檢測非洲豬瘟病毒最靈敏且廣泛應(yīng)用的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號對反應(yīng)進(jìn)程實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)從定性到定量。熒光定量PCR對核酸檢測的敏感性更高，特異性和檢測效率也得到了提高，是普通PCR的升級技術(shù)。

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的熒光定量PCR檢測技術(shù)是根據(jù)非洲豬瘟病毒基因組中的保守序列B646L基因（編碼p72蛋白）設(shè)計(jì)探針來進(jìn)行病毒基因擴(kuò)增，現(xiàn)在已建立多種病毒基因的熒光定量PCR檢測，例如廣州華醫(yī)測檢測科技有限公司與廣州悅洋生物技術(shù)有限公司一起研究開發(fā)的非洲豬瘟病毒p72和CD2v雙基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測方法，其擴(kuò)增效率在90%～110%，最低檢出限為7.3～24.5 copies/μL，有很好的敏感性和特異性[2]。此外，還有研究者開發(fā)了多重?zé)晒釶CR檢測方法用于不同豬病的鑒別診斷，如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)牛偉杰等[3]根據(jù)非洲豬瘟病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)了三重?zé)晒釶CR引物進(jìn)行多個(gè)病毒基因的檢測，該方法有利于臨床高效的鑒別診斷。

3.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Isothermal amplification technology,IAT）也是一種新型的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)、熒光重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。

3.2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是國外學(xué)者在21世紀(jì)初研究開發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，其反應(yīng)條件簡單，檢測結(jié)果肉眼即可判斷[4]。

LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品安全的病原微生物檢測、動(dòng)植物疫病診斷以及人類許多疾病的檢測中。如章小洪等[5]將LAMP技術(shù)用于食品中沙門氏菌的檢測，呂觀等[6]將LAMP技術(shù)用于牛肉中金黃色葡萄球菌，而在非洲豬瘟病毒檢測方面，王彩霞等[7]、James等[8]已研究報(bào)道了非洲豬瘟病毒LAMP檢測技術(shù)。

3.2.2 交叉引物擴(kuò)增技術(shù)

交叉引物擴(kuò)增（Crossing priming amplification,CPA）技術(shù)是我國第一個(gè)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)[9]。交叉引物擴(kuò)增需要設(shè)計(jì)3～8條互補(bǔ)引物，設(shè)計(jì)的引物可識別DNA中的特定位點(diǎn)，并使用具有等溫效應(yīng)的聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)設(shè)計(jì)的引物數(shù)量，可將交叉引物擴(kuò)增分為雙交叉擴(kuò)增和單交叉擴(kuò)增，在Bst DNA聚合酶作用下進(jìn)行目的片段延伸，不斷循環(huán)雜交以得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物添加熒光染料后置于紫外光下觀察，陽性樣品可觀察到熒光，陰性樣品不顯示任何熒光。交叉引物擴(kuò)增已被用于肺結(jié)核、雞呼腸孤病毒、雞腺病毒及牛腹瀉病毒等病原的檢測。Fr czyk等[10]開發(fā)了用于非洲豬瘟病毒檢測的CPA技術(shù)，可直接用于檢測家豬或野豬血液和血清中非洲豬瘟病毒的DNA片段，無需提取核酸。該方法具有很好的特異性和很高的靈敏，檢測結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果一致。

3.2.3 熒光重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

熒光重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase aided amplification,RAA）主要利用重組酶、DNA聚合酶等在39℃等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。趙凱穎等[11]選取非洲豬瘟病毒保守基因B646序列為靶基因建立了實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，采用50 μL反應(yīng)體系在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，檢測結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果一致。

4 不同病原學(xué)檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)

病毒分離進(jìn)行紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)仍然是病原學(xué)最敏感的檢測技術(shù)，但該方法對實(shí)驗(yàn)室人員、實(shí)驗(yàn)室條件及生物安全等條件要求嚴(yán)格，只能在特定的實(shí)驗(yàn)室開展，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室不能開展。紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)具有很高的特異性，但實(shí)驗(yàn)要求高且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)特異性好、靈敏度高，但實(shí)驗(yàn)條件及儀器設(shè)備要求高，需要PCR儀、核酸提取儀等儀器設(shè)備，對實(shí)驗(yàn)室人員素質(zhì)也有要求。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高，不需要PCR儀等昂貴的儀器且檢測時(shí)間短，結(jié)果判讀簡單易操作，可通過肉眼或電泳或比濁儀進(jìn)行判定。但其引物的設(shè)計(jì)較復(fù)雜，且不能擴(kuò)增較長的目的片段，易出現(xiàn)假陽性。交叉引物等溫?cái)U(kuò)增操作簡單，只需要在水浴鍋內(nèi)即可完成擴(kuò)增，但該檢測方法不穩(wěn)定，反應(yīng)體系復(fù)雜，也有假陽性出現(xiàn)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和交叉引物擴(kuò)增2種檢測方法的特異性沒有顯著差異，但靈敏度有差異，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的靈敏度達(dá)到90%，而交叉引物擴(kuò)增的靈敏度為70%，靈敏度都有待提高[12]。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)操作簡單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，但氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)較高。

5 小結(jié)

我國通過撲殺陽性豬群并做無害化處理，執(zhí)行嚴(yán)格的消毒，通過排查和監(jiān)測及時(shí)發(fā)現(xiàn)可疑病例及時(shí)處置；同時(shí)加強(qiáng)生豬調(diào)運(yùn)監(jiān)管，生豬跨省調(diào)運(yùn)實(shí)行嚴(yán)格的檢測和“點(diǎn)對點(diǎn)調(diào)運(yùn)”等，使非洲豬瘟疫情得以控制。自非洲豬瘟疫情發(fā)生至今，我國的疫情發(fā)生數(shù)量逐年下降，但不可否認(rèn)的是非洲豬瘟病毒已在我國“定殖”，實(shí)行非洲豬瘟病毒清除計(jì)劃將是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)和挑戰(zhàn)。

非洲豬瘟病毒檢測已成為基層獸醫(yī)隊(duì)伍的一項(xiàng)長期工作，在進(jìn)行疫病防控時(shí)，可靠和快速的診斷對于防止疫情蔓延至關(guān)重要。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的非洲豬瘟檢測方法包括病毒分離、熒光PCR、ELISA等。實(shí)時(shí)熒光PCR應(yīng)用最廣泛，其靈敏度和特異性均可滿足檢測的需要，但檢測成本較高，等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)作為低成本的快速檢測方法，在某些場合可作為熒光定量PCR檢測法的替代方案。