慢性胰腺炎易感基因及致病機制研究新進展

姜春暉 王奇雯 鄒文斌

上海市胰腺疾病研究所，海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200433

【提要】 CP是一種多因素、多基因參與的慢性進行性炎癥性疾病。隨著人類基因組技術的不斷發展，新的CP易感基因相繼被發現，相應的致病機制如胰蛋白酶(原)依賴通路、蛋白質錯誤折疊、細胞凋亡或壞死、自噬障礙、鈣離子信號通路異常和腸道微生態失調等被認為參與CP的發生和發展。本文系統闡述近年來新發現的CP易感基因及其致病機制，以加深對遺傳因素在CP致病作用中的認識。

CP是一種與遺傳因素密切相關的慢性進行性炎癥性疾病，臨床表現為腹痛、胰腺內外分泌功能不全(糖尿病、脂肪瀉)等，病理特征主要是胰腺纖維化、鈣化、萎縮、胰管不規則擴張、假性囊腫等。經典的CP致病基因包括陽離子胰蛋白酶原(serine protease 1,PRSS1)、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(serine peptidase inhibitor Kazal type 1,SPINK1)、胰凝乳蛋白酶C(chymotrypsin C,CTRC)和囊性纖維化跨膜轉導調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)[1]。雖然酒精、吸煙等環境因素和上述已知的基因突變等遺傳因素被證實是CP的重要危險因素，但僅能解釋不到50%的CP患者發病風險。本文就近年來新發現的CP易感基因及其致病機制做系統闡述，以加深對CP發生機制的認識。。

一、CP易感基因

隨著高通量基因測序技術的應用發展，通過靶向測序、全基因組測序(whole-genome sequence, WGS)和全外顯子測序(whole-exome sequence, WES)等方法定位CP易感基因位點，可以明確遺傳因素與疾病的關聯。全基因組關聯分析(genome-wide association studies, GWAS)利用單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)標記信息和表型信息分析，定位與疾病相關的基因突變。WES對基因組所有外顯子捕獲富集后進行高通量測序。近年來，運用以上技術定位了幾種與CP相關的易感新基因位點。

1．緊密通道蛋白2(claudin-2,CLDN2)和染色質重塑蛋白MORC家族CW型鋅指結構蛋白4(microrchidia family CW-type zinc finger 4,MORC4)：2012年，美國一項GWAS研究首次發表了與CP關聯度最高的SNP位于Xq23.3，即CLND2基因座[2]。CLDN2基因編碼claudin-2蛋白，該蛋白作為一種高度可調控的緊密通道蛋白，在內皮細胞間形成孔道，并具有陽離子通透性，通常以低水平在胰管和胰島細胞的緊密連接中表達。CLDN2基因座包含的其他基因有MORC4、RIPPLY1和TBC1D8B。研究進一步顯示，與復發性急性胰腺炎相比，CLDN2-MORC4基因座 rs12688220的變異與CP相關性更強，且與酒精性慢性胰腺炎(alcoholic chronic pancreatitis, ACP)顯著相關。隨后，德國、日本、印度等研究相繼論證了MORC4rs12688220與ACP顯著關聯，RIPPLY1rs7057398與女性的非酒精性慢性胰腺炎(non-alcoholic chronic pancreatitis, NACP)相關，無地域種族差異[3-5]。2020年，Deng和Li[6]的薈萃分析結果顯示，rs12688220和rs10273639 的基因多態性可用于識別亞洲人群中易感CP的個體。筆者所在課題組通過低深度全基因組測序發現，rs12688220和rs10273639均可增加CP患病風險，其中飲酒可通過劑量依賴關系顯著增加rs10273639的致病風險[7]。

2．胰脂肪酶(pancreatic lipase,PNLIP)：2014年，Behar等[8]對常染色體隱性遺傳的先天性PNLIP缺乏癥進行譜系研究，首次報道了PNLIPp.T221M的純合子錯義突變是引起胰腺外分泌功能障礙表型的原因。2019年，Lasher等[9]發現PNLIP錯義突變在2個獨立的歐洲NACP患者隊列中更為顯著，其中最常見的突變體為p.F300L(rs890551695)。功能實驗發現5個PNLIP突變體對蛋白水解敏感，表現為被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的加速降解，且與早發型CP密切相關。但在非歐洲(日本、美國、印度)NACP患者中未檢測到對蛋白酶敏感的PNLIP突變。PNLIP增加了CP易感風險，但也由于其對蛋白水解敏感，減輕了疾病的嚴重程度，具體致病機制有待進一步闡明。

3．ABO糖基轉移酶A/B和巖藻糖基轉移酶2(fucosyltransferase 2,FUT2)：一項基于人群的研究發現，血清脂肪酶活性閾值的升高(≥3.17 μmol/sl)與腎功能損害、高齡或各種調節免疫系統的藥物相關[10]。而這些因素都提示可能與亞臨床胰腺損傷或胰腺顯性疾病相關[11]。2014年Weiss等[12]展開GWAS和復制研究，確定了ABO基因座(rs8176693)、FUT2基因座(rs632111)與無癥狀受試者的血清脂肪酶活性表型顯著相關。進一步研究發現，次要等位基因ABOrs8176693_T是決定血型B的ABO單倍型；FUT2基因座與分泌狀態的關聯分析顯示，rs632111_G與FUT2蛋白的非分泌狀態相關。FUT2蛋白分泌與非分泌狀態決定了個體將ABO血型抗原分泌到體液中的能力[13]。繼而對1 042例胰腺炎患者行相關性分析得出，與血清脂肪酶活性增加相關的非分泌狀態FUT2(OR=1.53)和ABO血型中的B型血(OR=1.69)是CP患者的風險因素[12]。

4．胰凝乳蛋白酶原B1和B2(chymotrypsinogen B1 and B2,CTRB1-CTRB2)：CTRB1-CTRB2基因突變對CP致病影響存在種族差異性。2017年，歐洲一項納入1 959例ACP和1 650例NACP患者的GWAS研究顯示，CTRB1-CTRB2基因位點存在16.6 kb片段的倒置重組，導致mRNA轉錄水平上CTRB1/CTRB2亞型表達比升高和胰蛋白酶降解減少，以連鎖不平衡方式增加了ACP和NACP風險，CTRB1片段1號內含子SNP rs8055167(OR=1.35)與ACP明顯相關[14]。然而，筆者所在的課題組通過納入一項1 036例ICP患者的研究，結果顯示倒置重組的CTRB1-CTRB2、rs8048956和 rs8055167突變在中國人群中因等位基因固定現象而與ICP發病風險無顯著相關[15]。最近，德國一項對337例CP的CTRB1-CTRB2基因型研究顯示，存在CTRB1p.W5L、CTRB2的5′非翻譯區c.-4C>T和p.A247T的錯義突變，但未發現與CP發病顯著相關[16]。

5．瞬時受體電位陽離子通道亞家族V6 (transient receptor potential vanilloid subfamily member 6,TRPV6)：TRPV6基因編碼選擇性鈣離子通道蛋白。2016年意大利一項靶向測序研究首次報道了在ICP患者中存在TRPV6基因錯義突變位點[17]。2020年一項多中心WES和靶向測序研究顯示，日本及歐洲(法國、德國)NACP患者存在多個TRPV6功能缺失型突變位點(p.R174X, p.A606T, p.L608R, p.L609F)，日本患者p.D324N和歐洲患者p.L299Q突變可導致無Mg2+胞內灌注下TRPV6通道電壓依賴性阻斷，使膜通道功能障礙而誘發CP[18]。筆者所在課題組通過對669例CP患者進行測序及功能研究發現，TRPV6功能缺失型突變與CP顯著相關，在25個突變位點中的4個功能缺失型突變位點(p.L172P、p.A473T、p.Y507*和p.E575K)可導致TRPV6蛋白質翻譯顯著下降[19]。此外，最新的一項研究也表明，在兩個獨立的歐洲隊列中TRPV6功能缺失變異與CP風險升高相關[20]。

二、遺傳致病機制

CP易感基因突變和重組引起基因轉錄和翻譯產物的結構和功能異常，通過遺傳致病機制包括胰蛋白酶(原)相關通路、蛋白質錯誤折疊、細胞凋亡或壞死、自噬障礙、鈣離子信號通路異常和腸道微生態失調等，促進疾病的發生和發展。

1．胰蛋白酶(原)相關通路 ：近年來對CP易感基因突變的研究主要集中在引起活性胰蛋白酶水平升高致組織損傷的胰蛋白酶(原)相關通路上，如PRSS1、CTRC、SPINK1等位點突變導致胰蛋白酶(原)異常激活、胰蛋白酶降解障礙或抑制酶活性降低。PRSS1p.N29I/T和p.R122H促進胰蛋白酶原自我激活，p.N29I/T、p.V39A、p.R122C/H抑制CTRC介導的胰蛋白酶原降解，p.A16V和p.N29I促進依賴CTRC的胰蛋白酶原激活肽N端加工所致的胰蛋白酶原自激活[21]。PRSS2基因編碼陰離子胰蛋白酶原，p.G191R產生新的剪切位點Arg191-Gly192致激活后快速降解，使胰蛋白酶活性喪失，在CP中起保護作用[22]。筆者所在課題組基于PubMed搜索的含法國、中國等人群中PRSS1和PRSS2基因的拷貝數或SNP位點，以及基因動物模型分析，發現增加胰蛋白酶的表達量可顯著增加CP風險與疾病嚴重程度，這為未來研發干預藥物提供了理論基礎[23]。CTRCp.G217R/S、p.K247_R254del和p.R254W易被胰蛋白酶降解[24]。功能缺失型SPINK1突變使抑制胰蛋白酶自激活的保護機制喪失。筆者所在課題組通過體外構建全長SPINK1基因質粒，發現SPINK1c.194+2T>C改變3號內含子5′剪切位點，從而導致外顯子跳躍，使SPINK1mRNA表達顯著降低[25]；c.-108G>T、c-142T>C和c.-147A>G顯著降低啟動子活性，增加疾病風險；與c.194+2T>C關聯的c.-215G>A位點突變可增加啟動子活性，補償并降低轉錄區突變的有害影響[26]。CFTRp.M470V與關聯突變位點p.Q1352H或p.L1156F能顯著減少CFTR表達和降低Cl-/HCO3-轉運活性，使導管內堿性胰液分泌減少，易致蛋白沉積和pH降低，進而促進胰酶激活，其具體機制仍需深入研究[27]。

2．蛋白質錯誤折疊-內質網應激通路：基因突變導致翻譯的蛋白質未折疊或錯誤折疊，并在細胞內蓄積，引起內質網應激和蛋白質毒效應(酶分泌減少及活性下降)。CELp.C563fsX673使編碼的蛋白形成異常二硫鍵，在胞內以不可溶形式聚集，引起內質網應激、NF-κB通路激活和細胞凋亡標志物PARP降解產物增加[28]。CEL-HYB1及其雙位點錯義突變(Thr488-Ile548)均可引起胞內不溶性蛋白聚集和內質網應激[29]。筆者所在課題組通過構建人源性CEL-HYB1基因雜合變異小鼠，發現該變異隨著小鼠年齡的增長，可自發局部胰腺病變，增加雨蛙素誘導的胰腺炎嚴重程度，并伴隨蛋白質錯誤折疊和內質網應激，晚期出現自噬障礙[30]。 Hegyi和Sahin-Tóth[31]構建的CPA1N256K突變小鼠模型可使蛋白錯誤折疊和蓄積，引起內質網應激，且導致腺泡細胞空泡化增加、巨噬細胞浸潤、組織纖維化等CP特征性病理改變。

3．自噬障礙：自噬對維持胰腺腺泡細胞的生理功能及穩態起重要作用。Fjeld等[32]研究顯示，CEL-HYB1可致分泌障礙、異常蛋白胞內聚集，而微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)升高提示存在自噬功能障礙。研究顯示自噬相關蛋白5基因(autophagy related 5, ATG5)缺乏引起p62蓄積，激活Nrf2/Nqo1/p53信號通路致胰腺組織壞死、炎癥反應和纖維化[33]。Mareninova等[34]發現敲除溶酶體相關膜蛋白-2( lysosomal associated membrane protein-2, LAMP-2)基因的小鼠出現自發CP病理改變，組織中自噬溶酶體蓄積、腺泡細胞空泡化與增加的LC3-Ⅱ和p62/SQSTM1相關的自噬流缺陷有關。Li等[35]發現剔除IκB激酶α亞基(IκB kinase α, IKKα)基因的Pdx1-Cre，IkkαF/F雜交小鼠出現自發CP病理改變，與IKKα缺乏引起自噬障礙、內質網應激、氧化應激和p62蓄積有關。

4．鈣離子信號通路異常：胞內鈣超載可導致酶原異常激活、線粒體損傷、自噬異常和細胞壞死，在胰腺炎發生和發展中起重要作用。TRPV6功能缺失型突變可使TRPV6蛋白表達減少，細胞內鈣離子運輸顯著受損[18-19]。研究顯示內質網鈣離子感受器基質相互作用分子1(stromal interaction molecule-1,STIM1)基因突變與CP顯著相關。功能獲得型STIM1p.E152K位點突變使STIM1-肌漿內質網鈣泵構象改變，鈣泵活性增加，促進內質網鈣離子釋放，增加胞內胰蛋白酶原的激活和減少酶原分泌[36]。Piezo1是胰腺腺泡細胞中的非選擇性機械敏感性陽離子通道，調控鈣離子內流，胰管內高壓刺激和Piezo1激活劑可誘導胰腺炎。胰管內機械性刺激活化Piezo1通道蛋白，觸發TRPV4通道開放，引起持續性鈣內流，敲除TRPV4基因可顯著緩解Piezo1激活劑及胰管內高壓誘導的胰腺炎[37]。

5．腸道微生態失調：宿主基因型影響腸道微生物群，參與疾病表型的調節。Wang等[38]研究基因突變對CP患者腸道的影響，結果顯示CFTR突變的患者丁酸梭菌屬顯著減少，CASR、CTSB、SPINK1和(或)PRSS突變的患者瘤胃球菌屬顯著增加，功能分析顯示腸道菌群磷酸轉移酶豐富，而核糖體活性、淀粉和蔗糖代謝、氨基酰tRNA生物合成等缺乏。為研究腸道病毒在胰腺炎中的作用，Li等[39]對清除腸內常駐病毒的胰腺炎小鼠分析顯示，腸道病毒的清除可抑制腸道和胰腺組織Toll樣受體9(toll-like receptor 9, TLR9)mRNA和蛋白表達，減少炎癥細胞浸潤和組織損傷。

三、展望

上述研究分析了新發現的CP易感新基因突變及CP致病機制，然而仍存在以下局限性：首先，部分基因突變并未引起明顯的功能異常，是否存在因其他位點變異如啟動子、抑制子、轉座子等相互作用，使突變效應呈不完全顯性等需進一步確定；其次，新發現的突變基因仍需進一步功能研究以確定其與CP的關聯和具體致病機制；最后，不同的致病機制存在相互作用的可能，以及基因與環境因素如何發生交互作用有待進一步闡明。因此，未來仍有必要從遺傳學、細胞生物學、免疫學等多角度對CP致病機制進行深入研究，并對突變的臨床意義進行分類分型，為更好地精準診治CP提供基礎理論支持。

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