替代活化型巨噬細胞在胰腺纖維化中的作用研究進展

呂彥瑋 王麗娟 李兆申

海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化內科，上海 200433

【提要】 慢性胰腺炎是一種以胰腺纖維化為主要病理特征的慢性進展性疾病，以巨噬細胞為代表的免疫細胞在其發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在胰腺纖維化進程中，巨噬細胞以替代活化型(M2型)為主，可通過分泌大量抑炎和促纖維化因子改變組織纖維化-炎性微環(huán)境；分泌多種基質金屬蛋白酶及其抑制劑等影響細胞外基質降解與重塑；分泌TGF-β、PDGF等促細胞生長和增殖因子調控胰腺星狀細胞活化狀態(tài)，并可與之協(xié)同作用共同促進胰腺纖維化進程。本文旨在對M2型巨噬細胞在胰腺纖維化中的作用進行綜述，為以巨噬細胞為靶標的慢性胰腺炎相關治療提供理論基礎。

CP是由遺傳、環(huán)境等多種因素引起的以胰腺組織彌漫性纖維化為特征的慢性進展性疾病[1-2]。大量研究表明胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells, PSCs)是胰腺纖維化最主要的效應細胞。但近年研究發(fā)現(xiàn)以巨噬細胞為代表的免疫細胞可通過改變組織纖維化-炎性微環(huán)境、影響細胞外基質(extracellular matrix, ECM)降解與重塑以及調控PSCs活化狀態(tài)等機制在胰腺纖維化進程中發(fā)揮重要作用[3]。巨噬細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在免疫調節(jié)、穩(wěn)態(tài)維持以及組織損傷修復等過程中發(fā)揮重要作用[4]。巨噬細胞具有高度可塑性和多能性，在不同刺激條件下可發(fā)生不同類型極化，根據Gordon[5]提出的分類方案，可將其分為經典活化型和替代活化型。經典活化型又稱M1型，由LPS和(或)IFN-γ誘導發(fā)生，以產生活性氧和一氧化氮(NO)等物質為特征，主要發(fā)揮促炎和免疫監(jiān)察功能。替代活化型又稱M2型，由IL-4和(或)IL-13誘導發(fā)生，以細胞表面表達清道夫受體CD206為特征，具有抑炎、促組織損傷修復和促纖維化等作用。Sica等[6]認為，巨噬細胞M1型和M2型極化是其兩個極端狀態(tài)，其間存在不同極化狀態(tài)細胞共存現(xiàn)象，即其極化狀態(tài)是連續(xù)動態(tài)變化的。

不同極化類型的巨噬細胞具有顯著的特征性和功能性差異，在CP中以M2型極化為主，可通過分泌TGF-β、PDGF和IL-10等細胞因子影響PSCs活化和增殖，并分泌多種基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及其抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs)等影響ECM降解和重塑，從而參與調控胰腺纖維化進程[7]。目前已有大量綜述對巨噬細胞在AP中的作用進行總結闡述[8-9]，但針對胰腺纖維化進程中巨噬細胞的特性功能及其與PSCs間相互作用的研究較少，筆者所在團隊前期研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞與PSCs之間存在密切信號交流和協(xié)同活化，單獨抑制一種細胞活性無法有效阻滯胰腺纖維化進程[10-11]。因此，本文聚焦于M2型巨噬細胞在胰腺纖維化中作用的研究進展進行綜述，為CP的免疫治療提供理論依據。

一、M2型巨噬細胞在胰腺纖維化中的作用

在CP病程中，若胰腺損傷性因素持續(xù)存在或反復發(fā)生，可造成胰腺組織持續(xù)性炎癥反應以及免疫調節(jié)性細胞如Th細胞分化失衡，引起組織微環(huán)境中IL-10、IL-4 和 IL-13 等抑炎和促纖維化因子累積增多，促進PSCs持續(xù)過度活化和巨噬細胞M2型極化；二者相互作用可分泌大量ECM成分如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和纖連蛋白(fibronectin, FN)以及多種MMPs、TIMPs等影響ECM降解與重塑，最終導致胰腺纖維化的發(fā)生。

通常可作為巨噬細胞M1型極化的相關標志物有iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、CD80和CD86等，而M2型極化特征性標志物包括CD206、CD301、ARG1、YM1、IL-10和TGF-β等[6,12]。由于巨噬細胞的極化狀態(tài)是連續(xù)動態(tài)變化的，處于兩種典型極化類型之間的巨噬細胞可能同時表達M1型和M2型極化相關標志物。Xue等[3]對從CP小鼠胰腺中分離的單核或巨噬細胞進行相關極化標志物基因表達檢測，結果顯示，與對照組小鼠相比，CP小鼠來源的巨噬細胞M2型標志物基因如YM1、CD206、CD301、IL-10和TGF-β等的表達水平均明顯上調；流式細胞檢測亦證實M2型相關標志物表達量顯著上升，而M1型相關標志物MHC-Ⅱ和TNF-α下降或不變，表明在胰腺纖維化過程中M2型巨噬細胞占主導地位。已有多項研究證實，通過抑制巨噬細胞M2型極化可以顯著緩解CP小鼠胰腺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)通過封閉肽阻斷IL-4或IL-13誘導巨噬細胞M2型極化，或在巨噬細胞內敲除其相應受體IL-4Rα，均可顯著抑制CP小鼠胰腺纖維化[3]；Wang等[13]研究顯示成纖維細胞生長因子21可通過抑制巨噬細胞胰腺組織浸潤和M2型極化來減輕CP小鼠胰腺纖維化程度；筆者所在團隊前期研究也發(fā)現(xiàn)達沙替尼(Dasatinib)可通過抑制巨噬細胞M1、M2型極化來緩解小鼠胰腺纖維化[10]。

二、胰腺纖維化進程中M2型巨噬細胞的來源

胰腺組織中巨噬細胞來源主要包括組織駐留的巨噬細胞和從血液中募集而來的單核或巨噬細胞。其中組織駐留的巨噬細胞主要由胚胎形成期的卵黃囊及胎兒肝中的前體細胞分化而來[14]。Calderon等[15]研究表明，正常生理條件下，胰腺外分泌部駐留的巨噬細胞(F4/80+CD11b+)中約有半數(shù)細胞表達CD206和CD301，即呈M2型極化表型；而血液來源的單核或巨噬細胞起源于骨髓造血干細胞，經歷髓系祖細胞、粒細胞-單核細胞前體、單核-樹突狀細胞前體等一系列分化后進入血液循環(huán)系統(tǒng)，遷移至外周組織或器官發(fā)育成熟[12]。當胰腺組織發(fā)生損傷時，其中駐留的巨噬細胞會被激活，釋放多種促炎和趨化因子，大量募集血液中的單核細胞至胰腺損傷部位，經一系列轉變分化為巨噬細胞。此時，這些巨噬細胞以發(fā)生M1型極化為主，釋放多種促炎性細胞因子、趨化因子和MMPs等物質級聯(lián)放大炎癥反應[16]。隨著CP病程的進展，組織損傷修復失調以及PSCs持續(xù)過度活化，將導致IL-10、IL-4和IL-13等抑炎和促纖維化因子在組織微環(huán)境中積累增多，巨噬細胞也逐漸轉變?yōu)橐訫2型極化為主。

關于胰腺纖維化進程中M2型巨噬細胞的來源問題，目前尚無統(tǒng)一定論。一些學者研究認為其可能由急性炎癥期的M1型巨噬細胞轉化而來。Hashimoto等[17]在二丁基二氯化錫(DBTC)誘導的大鼠胰腺纖維化模型中研究證實，胰腺纖維化發(fā)生時胰腺組織浸潤的巨噬細胞有約44%共表達CD68/CD163，提示在胰腺纖維化過程中存在巨噬細胞由M1型向M2型轉化的現(xiàn)象；Wijesundera等[18]在大鼠肝硬化模型中也發(fā)現(xiàn)存在巨噬細胞M1型向M2型轉化的現(xiàn)象。然而，也有研究提示其可能由從血液中招募的單核細胞直接分化而來。Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與CCR2基因敲除小鼠相比，CCR2野生型小鼠胰腺組織中的巨噬細胞具有更高的CD206及IL4RA表達水平。CCR2是單核或巨噬細胞等髓源免疫細胞表面表達的重要趨化因子受體，可在相應趨化因子CCL2的濃度梯度引導下幫助相應免疫細胞到達組織炎癥部位[19]。因此，CCR2表達與否可用于區(qū)分組織內原本駐留的巨噬細胞(CCR2-)和由血液中單核細胞轉化而來的巨噬細胞(CCR2+)。上述研究結果提示，在小鼠胰腺纖維化過程中M2型巨噬細胞主要來源于早期被招募至炎癥區(qū)域的CCR2+單核細胞。此外，鑒于前述有研究顯示，正常生理條件下，胰腺外分泌部駐留的巨噬細胞中約有半數(shù)細胞呈M2型極化，這部分細胞雖然起始數(shù)量較少，也可能是胰腺纖維化中M2型巨噬細胞的來源之一。關于該問題以及巨噬細胞M1型至M2型的具體轉化機制等還需要更多實驗研究進一步證實。

三、M2型巨噬細胞促進胰腺纖維化的分子機制

1．自身特性：大量研究已表明，M2型巨噬細胞可分泌TGF-β、PDGF、IL-10等抑炎和促纖維化因子改變胰腺組織纖維化-炎性微環(huán)境，還可分泌MMP-2、9、13，TIMP-1、2、3以及其他蛋白酶類等成分影響ECM降解與重塑，參與調控胰腺纖維化進程[20-22]。

Legumain(Lgmn)是一種屬于半胱氨酸蛋白酶C13家族的天冬酰胺內肽酶[23]，有研究顯示其在CP患者胰腺組織中表達顯著上調[24]。Wang等[25]在腎間質纖維化模型中的研究表明，Lgmn主要高表達于CD206+M2型巨噬細胞。Ren等[26]研究表明，Lgmn可通過激活ECM中的TGF-β1活性促進胰腺纖維化進程，且在體外使用IL-4或IL-13處理可刺激巨噬細胞分泌Lgmn，提示M2型巨噬細胞是胰腺纖維化中Lgmn的主要來源；此外，他們還分別使用野生型小鼠、Lgmn全身敲除小鼠和Lgmn髓系條件性敲除小鼠構建雨蛙素誘導的CP模型，發(fā)現(xiàn)Lgmn表達水平在CP小鼠的血清和胰腺組織中均發(fā)生上調；且與野生型小鼠相比，Lgmn全身敲除及髓系條件性敲除小鼠的胰腺纖維化程度顯著減輕，進一步證實M2型巨噬細胞可通過分泌Lgmn影響ECM中TGF-β1的活性，從而參與調控胰腺纖維化和CP進程。

此外，Qi等[27]研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞還可通過分泌S100A4(一種分泌型S100家族鈣結合蛋白，在多種纖維化組織器官中高表達)參與調控肺組織成纖維細胞活化和ECM重塑過程。Savitri等[28]在皮膚傷口愈合模型中的研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞來源的培養(yǎng)上清能顯著加快傷口部位膠原合成、膠質細胞成熟和創(chuàng)口愈合，證實了M2型巨噬細胞分泌的多種細胞因子和趨化因子(如CCL5、CCL1、G-CSF等)對ECM重塑和組織創(chuàng)傷修復的重要作用。可見，M2型巨噬細胞是ECM重塑、組織損傷修復以及纖維化等生理或病理過程的重要調控者。

2．M2型巨噬細胞與PSCs的相互作用：PSCs是胰腺纖維化的主要效應細胞，其活化為胰腺纖維化初始階段最重要的胞內事件[29]。PSCs在正常情況下處于靜息狀態(tài)，當胰腺發(fā)生損傷時可被病灶部位產生的各種損傷相關模式分子以及浸潤組織的各種免疫細胞所釋放的多種促炎因子激活。活化后的PSCs增殖活躍，高表達α-平滑肌蛋白并可分泌大量Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN等ECM成分，參與組織修復；倘若修復過程出現(xiàn)異常，PSCs持續(xù)過度活化則可導致纖維化的發(fā)生[30]。

已有研究表明，CP患者和CP小鼠胰腺中均存在大量M2型巨噬細胞。Xue等[3]將小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)與從CP小鼠中分離的PSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMDM胞內IL-10、TGF-β、CD206和CD301等mRNA轉錄水平均顯著升高，提示與活化的PSCs共培養(yǎng)可促進巨噬細胞發(fā)生M2型極化；進一步研究證實PSCs是通過分泌IL-4或IL-13來促進巨噬細胞M2型極化的。此外，Shi等[31]將人源性PSCs系(IPS-1)分別與RAW 264.7和BMDM兩種不同巨噬細胞進行體外共培養(yǎng)，結果顯示，IPS-1細胞發(fā)生活化，產生片狀或絲狀偽足等形態(tài)學改變，提示巨噬細胞反過來也對PSCs活性產生一定影響。大量研究亦表明M2型巨噬細胞可通過分泌TGF-β、PDGF等細胞因子促進PSCs的增殖與活化[30,32]。

Treiber等[33]對巨噬細胞中NF-κB信號通路的關鍵轉錄因子RelA/p65行基因敲除后發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞中產生的多種促炎因子明顯下調，胰腺纖維化程度亦顯著減輕，提示p65的表達對巨噬細胞活化和胰腺纖維化過程起重要調控作用。而Wu等[34]在PSCs中使用p65 siRNA對p65基因表達進行敲低處理，結果顯示與對照組相比，p65 siRNA處理組PSCs的培養(yǎng)上清可顯著抑制BMDMs遷移及MCP-1的產生，說明PSCs誘導巨噬細胞胰腺遷移的過程與p65的表達和活性相關。RelA/p65是NF-κB信號通路中參與調節(jié)炎癥、細胞增殖及凋亡的關鍵性轉錄因子[35]。上述研究表明NF-κB信號通路在巨噬細胞與PSCs間相互作用以及胰腺纖維化進程中發(fā)揮重要作用。

四、總結與展望

綜上所述，在胰腺纖維化進程中，M2型巨噬細胞占主導地位，且其與PSCs間存在協(xié)同活化作用。一方面，活化的PSCs可通過分泌IL-6、CCL2等趨化因子招募血液中單核細胞向胰腺組織遷移，還可通過分泌IL-4、IL-13等細胞因子促進已浸潤胰腺的單核或巨噬細胞向M2型極化；另一方面，M2型巨噬細胞亦可通過分泌IL-10和TGF-β等細胞因子以及Lgmn和S100A4等蛋白酶和信號分子影響PSCs的活化和增殖，且二者間的相互調控機制可能與NF-κB信號通路有關。M2型巨噬細胞與PSCs的協(xié)同活化作用通過合成并分泌大量促纖維化因子以及FN、膠原等ECM成分到組織微環(huán)境中，促進ECM重構和累積，最終加劇胰腺纖維化進程。未來還需要進一步深入研究胰腺微環(huán)境中各種不同類型細胞活性狀態(tài)和理化因子成分對巨噬細胞組織遷移和極化的影響，以及巨噬細胞對胰腺微環(huán)境的反調控作用和分子機制，為CP治療提供基礎免疫相關思路。

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