肺癌組織中lncRNA ZFAS1和hsa-miR-372-3p的表達與患者惡性特征及預后的關系

楊 曄，黨榮廣，張 靜，董 超，宋雪晶

(石家莊市人民醫院 1.腫瘤科一病區； 2.腫瘤科二病區，河北 石家莊 050000)

肺癌是常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率和病死率，隨著社會發展，其發病率也在不斷地增加，嚴重威脅著人們的生命健康[1]。因此尋找有效的生物標志物對肺癌的診治及預后有重要意義。鋅指結構反義轉錄本1(zinc finger antisense 1，ZFAS1)是位于染色體20q13上的新lncRNA，在多種腫瘤的發生發展中起促癌作用[2]。有研究認為，ZFAS1可能參與年齡變化導致肺腺癌發生過程，可能與肺腺癌不同分期也有一定關系[3]。miR-372-3p是miRNA家族的一員，參與調控包括膀胱癌[4]、乳腺癌[5]、肝細胞癌[6]等在內的多種腫瘤的發生發展過程。目前已發現，miR-372-3p與非小細胞肺癌細胞異常增殖及轉移密切相關[7]。但是關于ZFAS1、miR-372-3p與肺癌患者臨床病理特征及預后的關系目前尚不明確，因此本研究選取2015年3月至2016年10月石家莊市人民醫院收取的82例肺癌患者為研究對象，探究肺癌組織中lncRNA ZFAS1、hsa-miR-372-3p表達水平及與患者惡性特征及預后的關系，旨在為肺癌的早期診治和預后評估提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：選取2015年3月至2016年10月石家莊市人民醫院收取的82例肺癌患者為研究對象，手術切除患者的腫瘤組織和癌旁組織(距肺癌組織>5 cm)，其中男45例，女37例；年齡為32～74歲，平均年齡(53.7±12.2)歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期32例；胸膜受侵46例，胸膜未受侵36例；發生淋巴結轉移33例，未發生淋巴轉移49例；腫瘤高、中分化31例，低分化51例；腫瘤直徑≤3 cm 35例，>3 cm 47例；病理類型：腺癌27例，磷癌37例，小細胞癌18例。根據患者腫瘤組織中ZFAS1、miR-372-3p水平的中位數分為高表達組和低表達組，腫瘤組織ZFAS1、miR-372-3p表達水平與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型無關。納入標準：1)經病理組織活檢后確診為肺癌；2) 首次確診，入院前未接受過肺癌相關治療；3)病例資料完整者。排除標準：1)伴有其他腫瘤；2)入院前有傳染疾病；3) 神經系統異常，不能積極配合治療者；4)妊娠期或哺乳期患者。本研究均經患者及家屬簽署知情同意書，且經石家莊市人民醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑：Trizol試劑(北京百奧萊博科技有限公司)；RNA反轉錄試劑盒(北京祥生興業科技有限公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，引物(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測肺癌組織ZFAS1、miR-372-3p水平：在組織樣品中加入Trizol試劑并提取總RNA，根據RNA反轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA，進一步按照2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書進行qRT-PCR，PCR條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。ZFAS1、miR-372-3p的內參分別為GAPDH、U6，引物見表1。ZFAS1、miR-372-3p mRNA的相對表達水平根據2-△△Ct法得出。

1.2.2 隨訪：對肺癌患者進行5年的隨訪，確認患者的預后生存情況，隨訪時間截止至2021-10-30或患者死亡。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組患者組織中ZFAS1、miR-372-3p表達水平

與癌旁組織相比，腫瘤組織ZFAS1、miR-372-3p表達水平均顯著升高(P<0.05)(表2)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

表2 兩組ZFAS1和miR-372-3p表達水平

2.2 ZFAS1、miR-372-3p水平與肺癌患者惡性特征的關系

根據患者腫瘤組織中ZFAS1、miR-372-3p水平的中位數分為高表達組和低表達組，與TNM分期、是否發生胸膜轉移、是否發生淋巴結轉移、腫瘤分化程度有關(P<0.05)(表3)。

表3 ZFAS1、miR-372-3p水平與肺癌患者惡性特征的關系Table 3 Correlation between ZFAS1, miR-372-3p levels and malignant characteristics of patients with lung cancer

2.3 肺癌組織中ZFAS1和miR-372-3p的相關性

肺癌組織中ZFAS1和miR-372-3p表達水平呈顯著正相關(r=0.477，P<0.001)(圖1)。

圖1 肺癌組織中ZFAS1和miR-372-3p的相關性Fig 1 Correlation between ZFAS1 and miR-372-3p in lung cancer

2.4 ZFAS1、miR-372-3p水平與肺癌患者預后的關系

ZFAS1高表達組患者5年內生存率為29.27%(12/41)，顯著低于ZFAS1低表達組的58.54%(24/41)，miR-372-3p高表達組患者生存率為24.39%(10/41)，顯著低于miR-372-3p低表達組的63.41%(26/41)(P<0.05)(圖2)。

圖2 Kaplan-Meier法分析ZFAS1、miR-372-3p水平與肺癌患者預后生存的關系

2.5 COX回歸分析肺癌患者不良預后的危險因素

腫瘤分化、是否發生胸膜轉移、TNM分期、是否發生淋巴結轉移、ZFAS1、miR-372-3p是肺癌患者發生不良預后的影響因素；TNM分期、淋巴結轉移、ZFAS1、miR-372-3p是肺癌患者發生不良預后的獨立危險因素(P<0.05)(表4，圖3)。

表4 COX回歸分析肺癌患者預后的影響因素Table 4 Prognostic factors of lung cancer patients by COX regression analysis

圖3 COX回歸分析影響肺癌患者預后的因素Fig 3 Factors influencing the prognosis of patients with lung cancer by COX regression analysis

3 討論

LncRNA是一類大于200 nt的非編碼RNA，可通過調控下游靶點的表達而參與多種疾病的發展[8]。ZFAS1最初在乳腺癌中發現異常表達，后在多種腫瘤中均發現表達上調，有促進腫瘤發展的作用[9]。ZFAS1在非小細胞肺癌晚期患者的肺組織中表達顯著上調，當其被敲低時，癌細胞的增殖、侵襲能力有所下降，體外非小細胞肺癌細胞的凋亡率增加，從而抑制腫瘤生長[10]。肺腺癌組織和細胞中同樣發現ZFAS1明顯上調，ZFAS1的敲低可抑制肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[11]。本研究中，腫瘤組織ZFAS1的水平較癌旁組織明顯升高，提示ZFAS1參與了肺癌的發生及病理發展過程，且腫瘤組織中ZFAS1水平與患者的生存密切相關，臨床中應關注ZFAS1高水平的患者，搭配個性化治療方案，提高患者的生存期。miRNA是一類長度為20～25 nt的長鏈非編碼小RNA，雖然只占人類所有基因的2%，但可以調控約30%的基因表達，廣泛參與腫瘤的發生發展，當前已成為臨床研究的熱點[12]。有研究證明miR-372-3p在多種腫瘤中發揮促進作用，肺鱗狀細胞癌組織中miR-372-3p水平較癌旁組織顯著上調，通過體外實驗發現，miR-372-3p可促進肺鱗狀細胞癌NCI-H520細胞系的活躍增殖[13]。丙泊酚可抑制肺癌細胞系A549細胞的活力、增殖、遷移和侵襲，加速細胞凋亡，而高水平的miR-372可逆轉這種現象，敲除miR-372產生相反的效果[14]。上述研究均證實了miR-372-3p在肺癌疾病中發揮促癌作用。本研究結果顯示，miR-372-3p參與調控肺癌的發生發展過程，推測miR-372-3p可能是肺癌診治和提高預后的潛在生物標志物，可為延長患者的生存時間提供合理治療手段。而腫瘤組織中的ZFAS1和miR-372-3p水平呈顯著正相關，提示二者之間之間可能存在某種關系，在肺癌中共同發揮致癌作用，但是具體機制目前尚不明確。

綜上所述，肺癌組織中ZFAS1、miR-372-3p呈異常高表達，其水平與肺癌患者惡性特征及預后有關，是肺癌患者預后不良的獨立危險因素，二者可能是治療肺癌的潛在治療靶點，對肺癌的分子機制研究有一定的參考價值。但是關于二者在早期肺癌中的診斷及預測價值目前尚不明確，還需進一步擴大樣本量，從多個角度、多方面對本研究結果加以驗證，為肺癌的診治提供可靠的參考數據。