慢性阻塞性肺疾病發病易感性與單核苷酸多態性相關

夏岑峰，王 娜，張 鵬

(寧夏醫科大學總醫院 心腦血管病醫院 呼吸與危重癥醫學科， 寧夏 銀川 750004)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmori-ary disease, COPD，簡稱慢阻肺)是一種常見的由有害氣體刺激所致的慢性肺部異常炎性疾病，一般以氣流受限且不完全可逆為特征。慢阻肺的發生表現出明顯的可遺傳特征[1]。目前，研究慢阻肺的候選基因有很多，主要集中在炎性相關基因：殼三糖苷酶/幾丁質酶1(chitotriosidase/chitinase 1，CHIT1)水平在慢阻肺患者體內明顯失調[2]，CHIT1的多態性對慢阻肺患者肺功能下降有顯著影響[3]；磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)與多種炎性細胞的環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水解有關。PDE4D基因rs16878037位點的多態性被證明與COPD顯著相關，且存在種族間差異，在吸煙的慢阻肺病人中，PDE4D呈現出高表達[4]。由此說明，CHIT1和PDE4D均與慢阻肺疾病相關。

本研究選取中國漢族和中國蒙古族CHIT1基因的4個位點rs771576027、rs1402870472、rs61745299、rs527497633和PDE4D基因的1個位點rs117292391，研究基因多態性與慢阻肺發病的關系，為早期診斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例：收集寧夏醫科大學總醫院2015年7月至2018年7月被診斷為慢阻肺的患者，隨機選取漢族患者237例和蒙古族患者207例，共444例歸為患病組。另外，隨機選擇同期體檢的健康漢族人215例和蒙古族人219例，共434名作為對照組。對所有來診人群均進行了吸煙情況和幼兒時期呼吸病史等信息的記錄。本研究方案經寧夏醫科大學總醫院倫理審查委員會審查批準；所有參與研究的志愿者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑： 蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)、ddNTPs(Sigma公司)；其他試劑(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA的提取：采集外周血5 mL，EDTA抗凝后離心留取血細胞，依次加入細胞裂解液、核溶解液、蛋白沉淀液、異丙醇和75%乙醇處理后，加入ddH2O，65 ℃水浴2 h。利用nanodrop-2000儀器檢測提取出的DNA的濃度及純度。

1.2.2 基因型的檢測：對目的SNP序列進行擴增，反應程序為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環45次；72 ℃ 5 min。再加入SAP用于消除多余的dNTPs和引物，反應程序為：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。之后加入單個ddNTP進行單堿基延伸反應，反應程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，循環45次；72 ℃ 3 min。將最終反應產物點樣于芯片上，通過Sequenom MassARRAY SNP檢測平臺，利用質譜分析技術對PDE4D基因和CHIT1基因上的所有位點進行基因分型檢測。其中每個位點的call rate參數值設置為>90%，最終得到基因位點的描述性統計。

1.3 統計學分析

應用SPSS.19軟件對數據進行統計學分析，采用Logistic回歸得出優勢比(OR/Exp)和95%置信區間；校正吸煙情況和幼兒呼吸病史因素的影響后，對SNP位點與慢阻肺的易感性進行關聯分析。用卡方檢驗方法對各基因型和等位基因頻率分布進行分析。得到的數據計量以n(%)的形式表示。使用SPSS方差分析Bonferroni法兩兩比較校正P值作為顯著性評判標準。

2 結果

2.1 兩組的基本信息

將878份就診病例(其中對照組434例，患病組444例)的基本信息進行卡方檢驗，吸煙與否及rs61745299(CHIT1)、rs117292391(PDE4D)的基因型分布頻率與患病存在顯著差異(P<0.05)(表1)。蒙族和漢族之間無顯著差異(表2)。

表1 患病組與對照組的基本信息

表2 不同民族人群基因型Table 2 Genotypes of different nationalities

2.2 Logistic回歸分析

吸煙能夠增加慢阻肺疾病的發生風險(P<0.05)；吸煙人群發生慢阻肺的風險比不吸煙人群高約1.4倍(Exp=1.401, 95%CI=1.074～1.827)。

2.3 CHIT1基因與慢阻肺易感性的關系

CHIT1位點rs61745299的基因型和等位基因在患病組和對照組中的分布顯示，基因型CC和CG、等位基因C均為慢阻肺發生的危險因素，其中基因型CG和等位基因C在兩組間差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3 兩組中CHIT1的rs61745299位點基因型和等位基因分布Table 3 Genotype and allele distribution of rs61745299 in CHIT1 of the two groups[n(%)]

2.4 PDE4D基因與慢阻肺易感性的關系

PDE4D位點rs117292391的基因型和等位基因在患病組和對照組中的分布顯示，基因型AG和等位基因G為慢阻肺發生的危險因素，且都在兩組間差異顯著 (P<0.05)(表4)。

表4 兩組中PDE4D的rs117292391位點基因型和等位基因分布Table 4 Genotype and allele distribution of rs117292391 in PDE4D of the two groups[n(%)]

3 討論

CHIT1位于人類1號染色體q31-q32，共包含12個外顯子，長度約20 kb。CHIT1主要在髓樣細胞中表達，包括嗜中性粒細胞、成熟的單核細胞衍生的巨噬細胞、肺巨噬細胞、肺和腸中其他特定的組織巨噬細胞和上皮細胞。當細胞中的Toll 樣受體(Toll-like receptor，TLR)受到刺激后就會釋放出CHIT1[5]，CHIT1可以增強轉化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)受體的表達和信號傳導，還可以修飾組織的纖維化和氣道重塑[6]。由于COPD是由異常損傷和組織修復反應引起的慢性肺部疾病，因此CHIT1在疾病發生中的作用和致病機制非常重要。本研究證明了CHIT1的rs61745299位點的基因型CG和等位基因C增加患慢阻肺疾病的風險，CHIT1可能成為COPD的生物標志物。

一方面，PDE4D可以通過降解cAMP來調控炎性細胞[7]，進而調節免疫細胞功能，另一方面控制氣道平滑肌的舒張[8]。COPD是一種進行性發展的疾病，與遺傳因素相關。日本人群中PDE4D的rs829259位點與COPD發病相關，而中國人群中PDE4D上的rs35386位點與COPD發病相關[9]。本研究發現PDE4D上的rs117292391位點與COPD發病相關，且基因型AG和等位基因G會增加發病風險。

吸煙是導致COPD的重要因素之一。吸煙患者體內α1-抗胰蛋白酶(AAT)和中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的變化進而引起對COPD易感[10]。肺部的抗氧化系統失衡形成的氧化應激也會導致COPD的發生[11]。總之，COPD是遺傳因素與環境因素相互作用的結果，其易感性與二者均有關系。

根據本研究結果，CHIT1的rs61745299位點和PDE4D的rs117292391位點在漢族和蒙古族患者之間不存在顯著差異，但這兩個位點的多態性單獨在漢族群體或蒙古族群體中是否與慢阻肺顯著相關，需要進一步分析和驗證。