IL-6反式信號傳導通路抑制劑sgp130Fc抑制膿毒癥小鼠炎性反應及調節免疫細胞

石丹丹，蔣素芳，王 茜，趙鵬博，劉 雅

(河北醫科大學第二醫院 麻醉科, 河北 石家莊 050000)

膿毒癥(sepsis)是由于宿主對感染的反應失調而導致的危及生命的器官功能障礙綜合征[1]，是全球重癥監護病房(ICU)患者的主要死亡原因之一[2]。盡管目前在臨床認識、疾病定義和免疫病理生理學方面的進步已經提高了膿毒癥的總體存活率，但膿毒癥的長期病死率仍然很高[3]，而幸存的膿毒癥患者表現出長期免疫功能障礙、免疫抑制、持續性炎性反應的狀態[4]。

白介素-6 (interleukin-6, IL-6)是一種多源性細胞因子，膿毒癥患者的血清中IL-6升高[5]。最近的研究表明，IL-6在血管中的促炎作用主要是通過其受體(sIL-6R)作用于IL-6反式信號傳導通路介導完成[6]。已知IL-6反式信號通路參與多種炎性疾病的發病機制，包括關節炎、神經系統疾病、肺纖維化和癌[7-9]，而選擇性抑制IL-6反式信號通路是否能改善膿毒癥尚不清楚。因此本研究擬利用膿毒癥模型小鼠，探討抑制IL-6反式信號通路對膿毒癥小鼠免疫炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡SPF級雄性 C57BL/6J小鼠80只(22～24 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司)，在22～25 ℃、12 h光暗循環照明下適應性飼養1周。鼠源sgp130Fc 蛋白(SinoBiologicl公司)；IL-6、IL-10、MCP-1及TNFα ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術有限公司)；紅細胞裂解液(Solarbio公司)；CD45 (PE-Cyanine7, clone 30-F11)、CD3e (FITC, clone 145-2C11)、 CD4 (PE, clone GK1.5)、 CD8a (PerCP-Cyanine5.5, clone 53-6.7)和 CD19 (APC, clone 1D3)(eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將80只小鼠隨機分為4組：假手術組(sham，n=15)、膿毒癥組[盲腸結扎穿孔術法制備膿毒癥模型[10]，cecum ligation and puncture(CLP)，n=30]、膿毒癥+抑制劑sgp130Fc組(CLP+sgp130Fc，n=20)和sgp130Fc組(sgp130Fc，n=15)。假手術組僅開腹后縫合。CLP術后1 h，sgp130Fc組與膿毒癥+sgp130Fc組腹腔注射sgp130Fc 0.5 mg/kg。

1.2.2 ELISA檢測血漿中IL-6、IL-10、MCP-1及TNFα 水平：CLP 術后 24 h，ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-10、MCP-1及TNFα 濃度。

1.2.3 流式細胞測量術檢測外周血免疫細胞比例：CLP術后 24 h，取外周血制備單細胞懸液；在制備的細胞懸液中加入相應的抗體：CD45(PE-Cyanine7, clone 30-F11)、 CD3e(FITC, clone 145-2C11)、 CD4(PE, clone GK1.5)、CD8a(PerCP-Cyanine5.5, clone 53-6.7)和CD19(APC, clone 1D3), 4 ℃ 避光孵育 30 min；4 ℃、300×g離心5 min，棄上清液；最后加入含0.1% BSA的PBS重懸細胞。使用BD FACSVerseTM流式細胞儀分析樣本，數據用FlowJo 軟件處理。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 抑制劑sgp130Fc治療對小鼠存活率的影響

與假手術組比較，膿毒癥組小鼠存活率明顯降低(P<0.05)；與膿毒癥組小鼠比較，膿毒癥+sgp130Fc組小鼠存活率明顯回升(P<0.05)(圖1); 假手術組小鼠和sgp130Fc組小鼠存活率均為 100%。

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05compared with CLP group圖1 抑制劑sgp130Fc對膿毒癥小鼠存活率的影響Fig 1 Effect of sgp130Fc on survival rate of mice

2.2 抑制劑sgp130Fc治療對體質量的影響

與假手術組相比，膿毒癥組與膿毒癥+sgp130Fc組小鼠的體質量明顯減少(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with sham group圖2 抑制劑sgp130Fc對膿毒癥小鼠體質量的影響Fig 2 Effect of sgp130Fc on body weight of mice

2.3 各組小鼠炎性指標比較

CLP后24 h，與假手術組比較，膿毒癥組小鼠外周血中IL-6、 IL-10、 MCP-1和 TNFα 濃度升高(P<0.05)；與膿毒癥組比較，膿毒癥+sgp130Fc組IL-6、 IL-10、 MCP-1和TNFα 濃度回降(P<0.05)(圖3)。

2.4 各組小鼠外周血中免疫細胞的變化

CLP后24 h，與假手術組比較，膿毒癥組小鼠外周血 CD3+CD4+T淋巴細胞比例明顯降低，CD3+CD8+T淋巴細胞比例明顯升高，CD45+CD19+B淋巴細胞比例明顯降低(P<0.05); 與膿毒癥組比較，膿毒癥+sgp130Fc組小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細胞比例明顯升高，CD3+CD8+T淋巴細胞比例明顯降低，CD45+CD19+B 淋巴細胞比例明顯升高(P<0.05)(圖4)。

3 討論

炎性因子是膿毒癥發病機制中的一個重要因素，其中IL-6促進宿主防御感染和組織損傷，然而IL-6的過度合成會導致炎性因子風暴而引起急性嚴重全身炎性反應[11]。膿毒癥患者的IL-6在外周和中樞神經系統中均上調，且IL-6的水平相較其他炎性因子變化更為顯著[5]。雖然減少全身炎性反應有助于治療膿毒癥，但關于IL-6與膿毒癥免疫系統之間潛在關系的報道相對較少。本研究結果顯示，與假手術組比較，膿毒癥組存活率明顯降低，IL-6較其他炎性因子變化更為明顯，提示IL-6在膿毒癥中發揮重要作用。

IL-6信號通路包括兩種：通過膜結合受體(mIL-6R)的經典信號通路和通過可溶性受體(sIL-6R)的反式信號通路。在反式信號通路中，sIL-6R與循環中的IL-6結合，復合物與細胞膜上的gp130結合以啟動下游信號傳導。有證據表明，IL-6反式信號通路可能是IL-6諸多促炎性作用的原因，經典信號通路則為抑炎作用[6]?，F有的抗IL-6治療藥物同時抑制經典信號和反式信號，而近年研究顯示同時抑制兩條信號通路的IL-6靶向抗炎方法在膿毒癥的治療中失敗[12]。Sgp130Fc通過與sIL-6R-IL-6復合體結合而阻止其與細胞膜上的gp130受體結合，選擇性抑制反式信號通路，且阻斷IL-6反式傳導信號不會損害人體對細菌感染的防御[13]，因此sgp130Fc是一種比IL-6或IL-6R抗體更好的IL-6阻斷藥物。

淋巴細胞是免疫系統的主要細胞，參與重要的體液免疫應答和細胞免疫應答。CD3+T 代表總T淋巴細胞，主要分為CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞, 機體感染時CD4+T細胞對免疫系統發出防御信息，CD8+T細胞抑制和抗擊感染細胞[14]。膿毒癥的免疫反應在數小時內從早期的高炎性反應階段轉變為晚期的低炎性反應和免疫抑制階段，這些不同的免疫狀態的特點是免疫監視功能受損，進而發展為持續性、復發性、繼發性的感染，進而導致死亡率增加[4]。本研究使用小鼠膿毒癥模型，發現通過使用sgp130Fc抑制IL-6反式信號通路可以有效減輕膿毒癥小鼠炎性反應，調節免疫細胞的平衡而改善膿毒癥小鼠的相關癥狀和表現，提高存活率。這表明IL-6反式信號通路與膿毒癥免疫炎性反應失衡有關，但其具體作用機制還需要進一步實驗探索。

綜上所述，抑制 IL-6反式信號通路可通過降低炎性因子水平和調節免疫細胞的失衡從而降低膿毒癥的病死率，顯示了sgp130Fc在免疫治療膿毒癥中的潛力。