半夏瀉心湯治療結直腸癌的作用機制探討*

樂音子，丁天雯，顧云慧，顏帥，謝金

南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院 江蘇蘇州 215009

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床常見的消化道惡性腫瘤，其發生率及死亡率分居全球惡性腫瘤第4位及第3位[1]。因其發病機制復雜，現有的根治性手術、化療等療法對部分組織器官產生不可逆損傷和化療耐藥，在治療上帶給結直腸醫師諸多困難與不利[2-3]。國內外多個Meta分析表明中醫藥聯合化療是結直腸癌綜合治療的重要武器，已取得長足 進步[4-5]。

張仲景所創的經典名方半夏瀉心湯顯示出無可比擬的臨床優勢，全方寒溫并用、辛開苦降、補瀉兼施，是治療痞證的代表方，文獻分析總結發現半夏瀉心湯在輔助晚期及術后CRC患者化療協同增效[6]、防治CRC化療患者口腔黏膜炎[7]、惡心嘔吐[8]、延遲性腹瀉[9]方面療效顯著。基礎實驗研究表明半夏瀉心湯通過誘導腫瘤細胞凋亡[10]、調控 PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制癌細胞的增殖和轉移[11]發揮抑瘤作用。單一的體內外實驗難以反映經典復方治療CRC涉及多成分、多靶點特點，本研究旨在通過網絡藥理學方法獲取半夏瀉心湯的活性成分，篩選核心靶標基因和通路，構建力求從系統層面探討其治療結直腸癌可能的作用機制，為經典名方在臨床應用和后續再研發提供參考和依據。

材料與方法

1 半夏瀉心湯的成分收集

在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數據庫中篩選出符合OB≥30%和DL≥0.18的活性成分，查找與半夏瀉心湯成分相關的文獻進行成分補充。

2 靶點的選擇

篩選出TCMSP數據庫提供的作用靶點，用Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數 據 庫 進 行 靶 點基 因 轉 化，在DisGeNET（http：//www.disgenet.org/search）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫中搜索“colorectal cancer”關鍵詞，查找與結直腸癌相關的疾病基因。使用Venny平臺匹配后獲得半夏瀉心湯治療結直腸癌的核心靶點。

3 核心靶點與疾病的關聯度及類型歸屬

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）數 據庫的VarElect模塊中導入半夏瀉心湯的核心靶點，設定病名為“colorectal cancer”，進而獲得核心靶點與疾病的關聯度。在DisGeNET（http：//www.disgenet.org/search）平臺中查找核心靶點的類型歸屬。

4 核心靶點蛋白相互作用的網絡構建

將半夏瀉心湯的核心靶點導入String數據庫（https：//stringdb.org/Version 10.5）中，研究的物種限制為人類，下載相關數據后在Cytoscape軟件中繪制蛋白質互作網絡模型。

5 藥物-活性成分-核心靶點-通路-疾病的網絡構建

將數據結果導入Cytoscape軟件中構建“藥物-活性成分-核心靶點-通路-疾病”的網絡模型。其中node代表半夏瀉心湯、活性成分、核心靶點、信號通路以及結直腸癌疾病，edge用來連接上述節點。通過構建該網絡模型進一步展示了半夏瀉心湯治療結直腸癌的作用機制。

6 核心靶點生物功能和通路的分析

將半夏瀉心湯10個核心靶點導入DAVID數據庫中，“background”限定為人類，選擇GO和KEGG Pathway富集模塊后開始分析。根據P值和靶點數量選出合適的富集結果，并運用Oring軟件將富集結果可視化。

結果

1 半夏瀉心湯活性成分的篩選

通過TCMSP 數據庫獲得半夏瀉心湯的化學成分1058個，通過限定OB≥40%，DL≥0.18后獲取半夏瀉心湯中以藥物成分吸收的候選活性成分121個，見表1。

表1 半夏瀉心湯中部分主要的活性成分

2 半夏瀉心湯治療結直腸癌的核心靶點

在TCMSP數據庫中獲得半夏瀉心湯2376個靶標基因，合并剔除后共獲得247個作用靶點，在Genecards和DisGeNET數據庫中共篩選出和結直腸癌相關的靶點204個，運用Venny平臺進行匹配后獲得10個半夏瀉心湯治療結直腸癌的核心靶點，見 圖1。

圖1 半夏瀉心湯治療結直腸癌的核心靶點

3 核心靶點與疾病的關聯度及類型歸屬

將10個核心靶點導入VarElect平臺中獲得核心靶點與疾病的關聯度，結果可見TP53、CCND1、AKT1與疾病關聯度相對較高；在DisGeNET平臺中進行核心靶點類型歸屬，顯示半夏瀉心湯治療結直腸癌過程主要涉及到了轉錄因子、信號分子、氧化還原酶等物質，見表2。

表2 半夏瀉心湯活性成分靶點信息

4 核心蛋白質相互作用的網絡分析

將半夏瀉心湯治療結直腸癌的10個核心靶點導入String數據庫中獲得蛋白質相互作用數據，并在Cytoscape軟件中可視化。結果顯示該網絡共有10個節點和32條邊。Degree值用node的大小和顏色深淺表示，combine score值用edge的粗細表示，排名較前的靶蛋白為TP53、AKT1、CCND1。該網絡提示半夏瀉心湯的核心靶點通過相互協同增強防治結直腸癌，見圖2。

圖2 半夏瀉心湯的蛋白質相互作用網絡

5 核心靶點生物功能和通路的分析

利用DAVID數據庫對半夏瀉心湯活性成分對應的潛在靶標基因進行GO和 KEGG分析。GO分析顯示半夏瀉心湯10個核心靶點的生物過程主要為細胞凋亡過程的調節、細胞增殖的負調節、炎癥反應、端粒酶活性的負調節等，見圖3；分子功能主要涉及酶結合、蛋白質合成、轉錄調節區DNA結合、蛋白質磷酸酶2A合成等，見圖4；細胞組分主要涉及細胞質、線粒體、蛋白質復合物等，見圖5。KEGG通路富集分析顯示半夏瀉心湯治療結直腸癌的靶標基因主要富集癌癥的途徑、P53信號通路、細胞凋亡、AMPK信號通路、鞘脂信號通路等，見圖6。上述結果顯示半夏瀉心湯的核心靶點富集在多個生物功能和通路內，提示半夏瀉心湯可通過協調多種途徑來發揮治療結直腸癌的作用。

圖3 GO富集分析生物過程

圖4 GO富集分析分子功能

圖5 GO富集分析細胞組分

圖6 KEGG通路富集分析結果

6 “成分-靶標-通路網絡”的構建分析

將半夏瀉心湯、活性成分、核心靶點、主要通路和結直腸癌導入Cytoscape軟件中構圖，結果顯示在半夏瀉心湯的121個活性成分中，與核心靶點相連的有99個，與主要通路相關的靶點有6個。其中排名較前的活性成分為槲皮素、山奈酚、柚皮素、甘草查爾酮A。排名較前的靶點為PTGS2、PPARG、AKT1、BAX，主要的通路為P53信號通路、神經營養因子信號通路、AMPK信號通路，上述結果表明半夏瀉心湯是通過多成分、多靶點、多通路的防治結直腸癌，見圖7。

圖7 半夏瀉心湯成分-靶標-通路多維網絡

討論

本文借助靶標預測、網絡構建、GO富集和通路富集分析相結合的網絡藥理學手段從系統層面探究半夏瀉心湯治療結直腸癌的作用機制，為下一步的基礎研究提供理論支持。

本研究所收集的半夏瀉心湯治療結直腸癌的主要活性成分有121個，其中人參、半夏、黃芩、大棗活性成分共為豆甾醇；黃連、甘草、大棗活性成分共為槲皮素；人參、甘草活性成分共為山奈酚；人參、大棗活性成分共為藍堇堿（原阿片堿）和malkangunin；人參、黃芩活性成分共為鄰苯二甲酸二異辛酯；黃連、黃芩活性成分共為表小檗堿；甘草、大棗活性成分共為Mairin（丁子香萜）；大棗、黃連活性成分共為Moupinamide穆坪馬兜鈴酰胺。其中有臨床常用藥對（人參與甘草、甘草與大棗、人參與黃芩、黃連和黃芩）的口服候選活性成分占據前十位，是半夏瀉心湯中發揮重要作用的主要藥對，可能與目前半夏瀉心湯中君臣佐使配伍有一定關系。豆甾醇是植物甾醇的一個組分，具有多種生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤[12]；藥理研究表明豆甾醇可顯著抑制人結腸癌細胞Caco-2、HT-29、SW480細胞增殖[13]。槲皮素作為一種膳食類黃酮，可通過下調Bcl-2、C-myc的表達水平抑制SW480細胞增殖[14]；還可擇性地激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）途徑抑制含有突變型或野生型KRAS的CRC細胞的增殖[15]。山奈酚通過激活ROS和p53介導的p38磷酸化和caspase凋亡通路誘導HCT116細胞亞G1期，G2/M期阻滯，增加TUNEL細胞的數量[16]。

本研究中“成分-靶標”互作網絡體現了半夏瀉心湯多成分、多靶點治療結直腸癌的特點，作用機理復雜。核心靶點與疾病分子對接結果提示半夏瀉心湯活性成分和關鍵靶標之間關聯度良好，證實網絡藥理學結果具有頗高的參考價值。結果同時發現，半夏瀉心湯治療結直腸癌的121個潛在靶標基因，主要功能靶標涉及 PTGS2、PPARG、AKT1、BAX等；GO富集顯示細胞凋亡和增殖等生物過程；蛋白質合成等分子功能。KEGG 信號通路富集分析提示與癌癥的途徑、P53信號通路、AMPK信號通路等密切相關。近年來越來越多的研究表明環氧合酶2（PTGS2）參與結直腸癌的形成、侵襲、轉移過程[17]，PPARG與許多致癌和腫瘤抑制途徑相互作用，這些途徑可能改變PPARG表達對生存的影響[18]；Akt1可能參與結直腸癌的發生發展和轉移，其表達情況有助于判斷結直腸癌的惡性程度和預后[19]；Bax基因高表達是大腸癌細胞自噬的負調控因子[20]，文獻研究藤黃酸提高Bax/Bcl-2水平抑制SW480、LOVO細胞增殖并誘導凋亡[21]。由此可知，半夏瀉心湯中主要活性成分槲皮素、山奈酚、柚皮素、甘草查爾酮A通過作用于PTGS2、PPARG、AKT1、BAX等靶標，調控P53信號通路、神經營養因子信號通路、AMPK信號通路等防治結直腸癌。

綜上，本研究依托網絡藥理學技術為進一步開發經典名方半夏瀉心湯基礎實驗指明方向，避免盲目的資源浪費。然而所有數據結果均基于公開數據庫和已發表文獻，無法涵蓋半夏瀉心湯中所有化學成分全部的信息；忽視單味飲片之間互相作用產生的新的化學成分；加上人體結直腸癌發生發展是一個動態復雜的過程，因此后續課題組將從基因組學、代謝組學相關的多組學技術聯合采用相關生物技術進一步闡明半夏瀉心湯防治CRC的作用機制。