補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療腰椎間盤(pán)突出癥的作用機(jī)制

鄧夢(mèng)，關(guān)永林，馬斌祥，張洋，常斌，姚鵬程

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅蘭州 730000 2 甘肅省中醫(yī)院 甘肅蘭州 730000

LDH是椎間盤(pán)退變、纖維環(huán)破裂、髓核突出，刺激或壓迫神經(jīng)根或脊髓引起的以腰腿痛為主要癥狀的綜合征[1]。研究表明，我國(guó)LDH發(fā)病率達(dá)7.62%，是造成第三位經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的疾病[2]。LDH包括手術(shù)治療和保守治療，但手術(shù)治療僅少數(shù)病情嚴(yán)重患者采用，多數(shù)患者采用保守治療，目前西藥保守治療短期效果較好，但存在較強(qiáng)毒副作用且作用短、費(fèi)用昂貴、易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)[3]。

LDH屬于中醫(yī)“腰痛” “痹證”等范疇，病位在腎、肝，病性是瘀、濕、寒、氣滯[4]，《諸病源候論》記載：“腎氣不足，受風(fēng)邪之所為也，勞則傷腎，虛則受于風(fēng)冷，風(fēng)冷與正氣交爭(zhēng)，故腰腳痛”、“夫勞傷之人，腎氣虛損，而腎主腰腳，其經(jīng)貫?zāi)I絡(luò)脊，風(fēng)邪乘虛，卒入腎經(jīng)，故卒然而患腰痛”[5]，治療以補(bǔ)腎活血祛瘀為主。中醫(yī)藥在LDH的治療中有不可替代的作用，其中補(bǔ)陽(yáng)還五湯能補(bǔ)氣活血通絡(luò)，有效緩解患者的癥狀，原方出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，用于治療氣虛血瘀之中風(fēng)，方中黃芪使氣旺以促血行；當(dāng)歸活血通絡(luò)；赤芍、川芎、桃仁、紅花活血祛瘀；地龍通經(jīng)活絡(luò)，引諸藥力直達(dá)絡(luò)中，全方共奏補(bǔ)氣、消瘀、 通絡(luò)之功[6]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)原理及方法，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療LDH的分子機(jī)制，并利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行初步驗(yàn)證，為補(bǔ)陽(yáng)還五湯用于治療LDH的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供參考。

資料和方法

1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘補(bǔ)陽(yáng)還五湯中赤芍、川芎、當(dāng)歸、地龍、紅花、黃芪、桃仁成分及作用靶點(diǎn)，根據(jù)成分毒藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）參數(shù)篩選有效成分，將藥物口服生物利用度 （OB）≥30%、藥物相似度（DL）≥0.18定義為篩選條件[7]，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[8]完成靶點(diǎn)的基因名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換。

2 LDH疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取

通過(guò)OMIM、DrugBank、GeneCards等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Lumbar disc herniation”為關(guān)鍵詞檢索LDH相關(guān)靶點(diǎn)，合并刪除重復(fù)值，得到LDH疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯潛在治療靶點(diǎn)獲取

將復(fù)方靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入網(wǎng)站Bioinformatics & Evolutionary Genomics進(jìn)行venn分析，獲得藥物與疾病交集靶點(diǎn)，認(rèn)為是復(fù)方潛在治療靶點(diǎn)。

4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將潛在靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[9]，構(gòu)建PP網(wǎng)絡(luò)； 結(jié)果導(dǎo)入至Cytoscape3.7.1通過(guò)network analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)度值（Dgree），節(jié)點(diǎn)顏色和大小代表節(jié)點(diǎn)度值，其節(jié)度值越大代表其在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，將節(jié)度值前12位定義為補(bǔ)陽(yáng)還五湯的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。

5 生物富集分析

將潛在靶點(diǎn)利用RStudio的“clusterProfiler”包進(jìn)行GO功能和KEGG 通路富集分析，設(shè)定P＜0.05，利用“ggplot2”包對(duì)顯著富集結(jié)果進(jìn)行作圖。

6 疾病-中藥-成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)1.3和1.5分析結(jié)合1.1和1.2的檢索，構(gòu)建疾病-中藥-成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，明確各節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

7 分子對(duì)接驗(yàn)證

將關(guān)鍵靶點(diǎn)及化合物進(jìn)行分子對(duì)接，驗(yàn)證其相互作用活性。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載，化合物從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載。利用Chem3D對(duì)化合物進(jìn)行能量最小化處理，PyMol對(duì)蛋白質(zhì)晶體去水、去除雜質(zhì)配體處理，利用AutoDockTool對(duì)蛋白質(zhì)晶體及化合物進(jìn)行加氫、加電荷處理后轉(zhuǎn)為PDBQT格式，利用AutoDockVina進(jìn)行分子對(duì)接，提取對(duì)接結(jié)果，利用PyMol對(duì)結(jié)合能力較強(qiáng)的進(jìn)行作圖[10]。

結(jié)果

1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效成分及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

獲得藥物有效成分共90個(gè)，其中赤芍29個(gè)，川芎7個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，紅花22個(gè)，黃芪20個(gè)，桃仁23個(gè)（未查找到地龍相關(guān)化合物，故舍棄），利用TCMSP進(jìn)行有效成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，具有作用靶點(diǎn)的化合物共62個(gè)，對(duì)其進(jìn)行編碼，見(jiàn)表1。

表1 中藥有效成分及編碼

2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯及LDH相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)檢索，獲得補(bǔ)陽(yáng)還五湯靶點(diǎn)245個(gè)，LDH靶點(diǎn)503個(gè)，將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集獲得共同靶點(diǎn)58個(gè)，代表補(bǔ)陽(yáng)還五湯的潛在治療靶點(diǎn)，繪制venn圖，見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病venn圖

3 PPI分析

將潛在靶點(diǎn)上傳STRING繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將結(jié)果利用可視化軟件分析，共58個(gè)節(jié)點(diǎn)，1948條作用關(guān)系，Dgree值靠前為IL6、IL1B、TNF等，代表補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)，圖2。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

續(xù)表1

4 生物富集分析

得到GO條目1358 條，其中生物學(xué)過(guò)程（BP）3308條、分子功能（MF）291條以及細(xì)胞組分（CC）185條，顯著富集結(jié)果如圖3所示。潛在治療靶點(diǎn)涉及的 BP 主要包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)、生物、環(huán)境刺激的反應(yīng)以及細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等。

圖3 GO分析氣泡圖

涉及KEGG通路211條，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異包括：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、查加斯病、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、癌癥中的蛋白多糖、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、百日咳、結(jié)直腸癌、前列腺癌、人巨細(xì)胞病毒感染、利什曼病、膀胱癌、Toll樣受體信號(hào)通路、肺結(jié)核、內(nèi)分泌抵抗，繪制氣泡圖，如圖4。

圖4 KEGG分析氣泡圖

5 疾病-中藥-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效成分-疾病-潛在靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖5，共148個(gè)節(jié)點(diǎn)，686條作用關(guān)系，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中多個(gè)化合物成分，能通過(guò)作用于多個(gè)靶蛋白調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，達(dá)到治療LDH的目的。

圖5 疾病-中藥-成分-靶點(diǎn)-通路圖

6 分子對(duì)接結(jié)果

關(guān)鍵靶點(diǎn)與化合物分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表2，納入結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol的對(duì)接結(jié)果，對(duì)對(duì)接活性強(qiáng)的前5組進(jìn)行繪圖，見(jiàn)圖6。補(bǔ)陽(yáng)還五湯中有效化合物能深入靶蛋白活性位點(diǎn)，并與其關(guān)鍵氨基酸殘基形成極性或非極性鍵，以穩(wěn)定配體和受體的結(jié)合[10]。

表2 分子對(duì)接結(jié)果

圖6 分子對(duì)接結(jié)果展示

討論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療氣虛血瘀癥的代表方，臨床上能抗炎、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)纖維修復(fù)，治療LDH有較好效果[11]。姜文淼[12]等發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合艾灸能減輕炎癥反應(yīng)、緩解疼痛、改善腰椎功能。裘興棟[13]等表明電針聯(lián)合補(bǔ)陽(yáng)還五湯能下調(diào)軟骨終板中VEGF、IL-1β表達(dá)水平，增加軟骨終板內(nèi)血管芽數(shù)目、降低鈣化層厚度，延緩椎間盤(pán)退變。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療LDH的成分及靶點(diǎn)、相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，篩選出補(bǔ)陽(yáng)還五湯中有效成分62個(gè)，作用靶點(diǎn)248個(gè)，潛在治療LDH靶點(diǎn)58個(gè)。

PPI顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯關(guān)鍵靶點(diǎn)包括IL6、IL1B、TNF等。IL-1β、TNF、IL-6 為促炎細(xì)胞因子，IL6參與急性炎癥反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)疼痛機(jī)制，通過(guò)激活MAPK/ERK、成骨分化、STAT3和β-連環(huán)蛋白等信號(hào)通路以及干預(yù)TIMP-1的活性影響椎間盤(pán)功能[14-15]，IL-1β在IVDD期間導(dǎo)致炎癥、基質(zhì)降解、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，通過(guò)干預(yù)NF-KB/p65信號(hào)通路，調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞中的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)[16-17]；TNF-α增加血管通透性，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡，引起IVDD[18-19]；AKT1作為一種促生存激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、血管損傷[20]；MMP9通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解參與IVDD進(jìn)程，與血液-脊髓屏障、更高的通透性和中性粒細(xì)胞遷移等過(guò)程有關(guān)[21-22]；VEGF能增加微血管通透性、促進(jìn)血漿纖維蛋白外滲形成血管、為細(xì)胞遷移提供纖維網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)椎間盤(pán)組織血管生成及浸潤(rùn)[23]；PTGS2參與炎癥、凋亡和免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子和趨化因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的生成和分化[24]；TP53和CASP3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和衰老[25]，趨化因子CCL2、CXCL8在椎間盤(pán)突出的疼痛機(jī)制中發(fā)揮重要作用[26]。

可視化分析及分子對(duì)接結(jié)果表明，山奈酚（Kaempferol）、黃芩素（Baicalein）、β谷甾醇（beta-Sitosterol）、槲皮素（Quercetin）化合物等與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能力較強(qiáng)，可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療LDH的關(guān)鍵成分，均有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槲皮素通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT、NF-κB等信號(hào)通路抑制細(xì)胞炎癥過(guò)程[27]；蔡美云[28]等實(shí)驗(yàn)研究表明，山奈酚通過(guò)激活p38/ MAPK信號(hào)通絡(luò)發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，鄒雪蓮[29]等研究表明山奈酚作為Nrf2激活劑參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高細(xì)胞對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用；黃芩素可通過(guò)上調(diào)miR-29a-3p的表達(dá)來(lái)抑制MAP2K6的磷酸化，以提高骨細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞凋亡[30]；β-谷甾醇能提高OPG與ODF的比值，調(diào)節(jié)骨代謝平衡，調(diào)控VEGF抑制滑膜血管生成，減少關(guān)節(jié)腫脹和破壞，具有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛抗炎等作用[3，31]。

生物富集分析表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療LDH涉及多條信號(hào)通路，其中與LDH關(guān)系密切的包括：糖尿病并發(fā)癥中的 AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路等。AGEs和RAGE的組合可以激活NF-KB、絲裂原激活的蛋白激酶或JAK/STAT途徑，以參與炎癥、增殖和運(yùn)動(dòng)，同時(shí)AGE-MG-H1的積累與IVDD中軟骨內(nèi)骨化、肥大和成骨分化有關(guān)[25-32]，TNF和IL-17途徑在IVDD的進(jìn)展中起著協(xié)同作用，主要通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的釋放、NPC的凋亡和ECM的降解[25]，IL-17A通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)、加速ECM降解、誘導(dǎo)血管生成和新神經(jīng)支配來(lái)影響IDD，也可以降低、調(diào)節(jié)IDD細(xì)胞的自噬水平[33]。TNF信號(hào)通路刺激破骨細(xì)胞分化和活化，引起骨丟失，刺激滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生降解軟骨的蛋白酶，導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞[34]，Toll樣受體（TLRs）能通過(guò)NF-κB、MAPK等通路調(diào)控基質(zhì)降解酶、TNFα、IL等炎癥因子參與IVDD，有研究在小鼠的椎間盤(pán)中注射MyD88抑制劑后，能夠消除炎性介質(zhì)LPS、IL-1B等引起的TLR2上調(diào)，并可降低MMP1、MMP13、 ADAMTS4和ADAMTS5的 表 達(dá)，證 明 了TLR2通過(guò)MyD88依賴途徑參與了IDD[35]。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)山奈酚、黃芩素、β谷甾醇、槲皮素等化合物通過(guò)AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路等通路，調(diào)控IL6、IL1B、TNF、AKT1、MMP9、VEGFA PTGS2、TP53、JUN、CASP3等、CCL2、CXCL8等細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管生成、髓核細(xì)胞增殖和凋亡的LDH相關(guān)生物過(guò)程。本研究初步挖掘補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療LDH的分子作用機(jī)制，可以為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供參考和借鑒。