稀有鮈鯽腦中KISS/GPR54系統介導MT對性腺發育影響研究

陳越，楊瓊，王賢珍，呂曉潔，榮偉雅，李宇星，劉青，王偉偉，宋晶，王憲宗，劉少貞,*

1. 山西農業大學動物科學學院，太谷 030801 2. 山西省水產技術推廣服務中心，太原 030002

環境內分泌干擾物（environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs）是常見的有機污染物，通過干擾生物體內源激素產生、分布和代謝等發揮其作用[1]。EDCs化學性質穩定，可以被機體吸收且不易降解[2]，通過食物鏈富集于魚體，最終危害動物及人體健康。研究表明，EDCs可以干擾水生生物內分泌系統和免疫系統[3]。EDCs包括類雌激素和類雄激素，雄激素類物質可以引起哺乳動物出現雄性化特征[4]，影響水生生物的組織器官正常功能，致使肝臟和性腺等器官出現多種病理變化[5]。

17α-甲基睪酮（17α-methyltestosterone, MT）具有合成簡單、成本較低、效果明顯等優點[6]。低濃度MT暴露可以誘導動物精子的發生及釋放，促進雄性器官發育，而高濃度使用可能導致魚類畸形或死亡[7]。MT添加投喂大口黑鱸（Micropterussalmoides），可以有效促進雌性幼魚轉變為雄性[8]。MT處理麥穗魚（Pseudorasboraparva）7 d，肝臟出現空泡化，細胞核固縮等現象且隨著MT濃度的升高和暴露時間的延長而加劇，性腺組織切片結果顯示，雄魚性腺出現精卵巢（testis-ova）現象[5,9]。

KISS/GPR54系統是由配體kisspeptin的編碼基因kiss及其受體GPR54組成，魚類kiss基因主要包括2個亞型kiss1和kiss2[10]，GPR54基因也有GPR54α和GPR54β這2個亞型。KISS/GPR54系統通過下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonad, HPG）軸調控促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone, GnRH）分泌和釋放，從而調節下游促性腺激素，促進性腺發育成熟[11]。d’Anglemont de Tassigny等[12]和Funes等[13]分別敲除小鼠kiss和GPR54基因，均出現不育和促性腺激素功能減退癥，對HPG軸功能造成嚴重影響。金魚（Carassiusauratus）成魚注射1 μg·g-1（以體質量計）的KISS-1，血清中促黃體素（luteinizing hormone, LH）水平顯著升高[14]，為歐洲舌齒鱸（Dicentrarchuslabrax）成魚注射250 ng·g-1（以體質量計）的KISS-2，血清中LH和促卵泡素（follicle-stimulating hormone, FSH）水平顯著升高[15]。

MicroRNAs（miRNAs）是一類長約22 nt的小分子非編碼RNA，在細胞分化、增殖、生長、衰老、凋亡、器官發育、代謝調節和細胞信息傳遞等多種生物學過程中發揮作用[16]，主要通過與靶基因3’非翻譯區（3’-UTR）結合來影響基因或蛋白的表達，從而促進mRNA降解或阻止蛋白質翻譯[17]。在多種魚類中，miRNAs參與調控配子形成和性腺發育[16]，測序數據顯示，MT處理后稀有鮈鯽卵巢中存在3 949組miRNA-mRNA對[18]。目前許多研究涉及HPG軸相關miRNAs，其中miR-9和miR-200控制GnRH神經元的發育[19]，miR-155和miR-200調控小鼠青春期前下丘腦GnRH的釋放[20]。miR-25-3p和miR-92a-3p屬于miR-25家族，可以與小鼠腦中kiss1基因的3’-UTR區結合，從而影響小鼠青春期的啟動以及動情周期[21]；中樞性性早熟女童血清中miR-137可以與kiss1基因的3’-UTR區結合發揮作用[22]；過表達miR-199-3p導致細胞MAPK pathway活性降低從而抑制kiss1基因表達[23]；miR-324-3p與kiss1基因的3’-UTR區結合抑制宮外孕早期kiss1基因的表達[24]。

稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）是我國極具代表性的魚種，具有生活史周期短，方便飼養，溫度、溶氧耐受范圍廣等優點，因此逐漸成為新型實驗動物[25]。在毒理學、病理學、遺傳學和基礎生物學等關鍵學科領域均有使用稀有鮈鯽作為試驗動物[26]。為探究MT干擾稀有鮈鯽生殖系統的作用機理，本研究采用0、25、50和100 ng·L-1的MT處理稀有鮈鯽7、14和21 d。qRT-PCR檢測稀有鮈鯽腦中kiss和GPR54基因mRNA及其相關miRNAs的表達變化情況，為探究MT在稀有鮈鯽體內的作用機理提供可靠的理論基礎，同時為進一步推進稀有鮈鯽成為我國特有水生模式生物提供依據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試驗動物

稀有鮈鯽選自山西農業大學水產科學系實驗室同一批繁殖的8月齡成魚。試驗共設置4個組，對照組為0.001%無水乙醇，低、中、高MT處理組濃度分別設定為25、50和100 ng·L-1，雌雄分開飼養，每個試驗組設置3個平行重復。本試驗用水選用曝氣24 h后的自來水，半凈水暴露，pH范圍7.6±0.2，水溫范圍（25±1） ℃，光/暗周期為14 h∶10 h。養殖魚的密度為1 g·L-1，每天吸污（殘餌和糞便）的同時換掉水族箱1/2的水，并加入等量的水和相應量的MT溶液，保證水族箱里MT濃度恒定。每天定時定量投喂紅蟲一次，投喂量為實驗組內魚總質量的3%，觀察并記錄各組試驗魚的健康狀況。取樣前1 d停止投餌，每組隨機選取18尾稀有鮈鯽，MS222麻醉后取腦和性腺組織，腦組織置于Trizol中研磨后-80 ℃保存備用，性腺置于波恩氏液中固定24～48 h，用于石蠟組織切片觀察。

1.2 石蠟組織切片制備

取出波恩氏液固定后的性腺組織，放置于包埋盒中，自來水緩沖12 h后酒精梯度脫水（50%、70%、80%、95%和100%乙醇中進行），二甲苯進行透明處理；將透明好的組織浸蠟包埋（多次熬制去除大部分雜質的石蠟），用鑷子將組織放于石蠟模具中，去除氣泡，放于65 ℃烘箱中透蠟30 min后取出，除去組織旁的氣泡自然降溫凝固，修整石蠟模塊。使用切片機將組織石蠟切成6 μm厚的組織，H-E染色法染色，中性樹脂膠封片處理，置于顯微鏡下觀察性腺組織病理學變化。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

取出超低溫冰箱保存的稀有鮈鯽腦組織，Trizol一步法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計測定純度和濃度。每份組織樣本取5 μL，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）反轉錄合成cDNA第一鏈，M5 miRNA cDNA Synthesis Kit合成miRNA對應的第一鏈cDNA。

1.4 定量引物合成

參考已有的稀有鮈鯽kiss1、kiss2、GPR54α和GPR54β的引物序列[27]，上海生工（Sangon Biotech）生物工程股份有限公司合成，普通PCR擴增，擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠電泳條帶單一，清晰可見。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對稀有鮈鯽腦中4個基因的相對表達水平進行檢測，每組檢測6尾魚。選擇常用內參基因ef1a、β-actin、gapdh和tuba1作為候選，參考已有引物序列[28]，篩選最佳內參基因。

參考實驗室已有的稀有鮈鯽第二代測序數據，使用DNAman軟件設計miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p的引物，qRT-PCR檢測稀有鮈鯽腦中5個miRNA的相對表達水平，每組檢測6尾魚，選擇U6作為內參基因（表1）。

1.5 內參基因篩選

qRT-PCR方法檢測β-actin、ef1a、gapdh和tuba1在對照組及MT處理組的表達量，使用GeNorm、BestKeeper和NormFinder[29]3種方法對4個候選基因表達穩定性進行評估，確定在MT暴露后仍然穩定的內參基因，保證實時熒光定量PCR結果的可信度。

1.6 實時熒光定量PCR

qRT-PCR檢測稀有鮈鯽腦中kiss1、kiss2、GPR54α和GPR54β基因的相對表達量。采用TB Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）試劑盒（TaKaRa，大連）進行試驗，每個組織設置3個重復，體系為20 μL（上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL（100 ng），熒光染料SYBR Green Ⅱ 10 μL，滅菌超純水ddH2O 6.4 μL）；采用M5 miRNA qPCR Assay Kit試劑盒（聚合美，北京）檢測稀有鮈鯽腦中miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p的相對表達量，每個組織設置3個重復，體系為20 μL（上下游引物各0.4 μL，miRNA第一鏈cDNA模板2 μL（100 ng），2× M5 miRNA qPCR Mixture （ROX） 10 μL，滅菌超純水ddH2O 7.2 μL），混合均勻后于冰上快速加到八連管中。PCR程序為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃復性30 s；40個循環；熔解曲線（95 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s）。

1.7 數據處理分析

采用F=2-ΔΔCq對獲得的mRNA和miRNA表達量數據進行處理，RT-qPCR數據處理采用2-ΔΔCq，計算公式為F=2-ΔΔCq，ΔCq處理組=（Cq目的基因處理組平均值-Cq內參）；ΔCq對照組=（Cq目的基因對照組平均值-Cq內參），ΔΔCq=ΔCq處理組-ΔCq對照組。運用SPSS 21.0進行統計學分析，采用單因素方差分析及Duncan’s多重比較檢驗法，P<0.05為差異顯著，用不同小寫字母表示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

2 結果（Results）

2.1 MT對稀有鮈鯽性腺組織學影響

25、50和100 ng·L-1的MT處理稀有鮈鯽7、14和21 d，雌雄魚的性腺發育均受到了抑制，卵巢中的成熟卵細胞數量減少，精巢中的成熟精子比例降低。并且隨著處理時間和濃度的變化，卵巢和精巢出現不同的變化。

2.1.1 MT對稀有鮈鯽雌魚性腺組織學影響

石蠟切片結果如圖1所示，MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，對照組卵巢發育良好，成熟卵細胞（Voc）數量較多，初級卵母細胞（Poc）和次級卵母細胞（Coc）數目正常；低濃度處理組成熟卵細胞比例無明顯變化；中濃度處理組和高濃度處理組成熟卵細胞比例明顯降低，初級卵母細胞和次級卵母細胞所占比例增加。

MT處理稀有鮈鯽14 d，對照組卵巢發育正常；低濃度處理組未觀察到成熟卵細胞，而未成熟卵細胞數量增多；中濃度處理組觀察到初級卵母細胞數量增加，次級卵母細胞和成熟卵細胞數量減少；高濃度處理組卵巢中存在大量初級卵母細胞和少量次級卵母細胞，細胞個體變小。

MT處理稀有鮈鯽21 d，對照組卵巢發育正常，細胞比例未發生顯著變化；低濃度和中濃度處理組均顯示初級卵母細胞數量增加，未觀察到成熟卵母細胞；高濃度處理組卵巢中存在大量發育初期的初級卵母細胞，未觀察到成熟卵細胞和次級卵母細胞。

2.1.2 MT對稀有鮈鯽雄魚性腺組織學影響

石蠟切片結果如圖2所示，MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，對照組精巢發育良好，精原細胞（Sg）、次級精母細胞（Sc）和成熟精子（Sz）所占比例正常；低濃度處理組未發生顯著變化；中濃度處理組和高濃度處理組精巢中成熟精子數量減少。

MT處理稀有鮈鯽雄魚14 d，對照組精巢發育良好，精原細胞、次級精母細胞和成熟精子所占比例正常；低濃度處理組和中濃度處理組未成熟的精母細胞和精原細胞的比例增加；高濃度處理組精巢中幾乎觀察不到成熟的精子，精原細胞和次級精母細胞數量增加。

圖1 17α-甲基睪酮（MT）對雌性稀有鮈鯽卵巢組織學影響（H-E染色，比例尺=200 μm）注：A1、B1、C1和D1為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雌魚7 d后的卵巢組織；A2、B2、C2和D2為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雌魚14 d后的卵巢組織；A3、B3、C3和D3為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雌魚21 d后的卵巢組織；Voc為成熟卵細胞，Coc為次級卵母細胞，Poc為初級卵母細胞。Fig. 1 Effects of 17α-methyltestosterone （MT） on ovary histopathology of female G. rarus （H-E stain, scale bars=200 μm）Note: A1, B1, C1, and D1 respectively represent the ovary tissue changes of the control group, 25, 50, and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 7 d; A2, B2, C2, and D2 respectively represent the ovary tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 14 d; A3, B3, C3, and D3 respectively represent the ovary tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of female fish for 21 d; Voc means vitellogenic oocyte; Coc means cortical alveolus stage; Poc means perinucleolar oocyte.

圖2 MT對雄性稀有鮈鯽精巢組織學影響（H-E染色，比例尺=50 μm）注：A1、B1、C1和D1為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雄魚7 d后的精巢組織；A2、B2、C2和D2為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雄魚14 d后的精巢組織；A3、B3、C3和D3為MT（對照組、25、50和100 ng·L-1）處理雄魚21 d后的精巢組織；Sz為成熟精子，Sc為次級精母細胞，Sg為精原細胞，V為空泡化。Fig. 2 Effects of MT on testis histopathology of male G. rarus （H-E stain, scale bars=50 μm）Note: A1, B1, C1, and D1 respectively represent the testis tissue changes of the control group, 25, 50, and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 7 d; A2, B2, C2, and D2 respectively represent the testis tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 14 d; A3, B3, C3, and D3 respectively represent the testis tissue changes of the control group, 25, 50 and 100 ng·L-1 MT treatment groups of male fish for 21 d; Sz means spermatozoo; Sc means spermatocyte; Sg means spermatogonium; V means vacuolation.

MT處理稀有鮈鯽雄魚21 d，對照組精巢發育良好，各細胞比例正常；低濃度處理組和中濃度處理組成熟精子所占比例減少，出現少量細胞空泡化現象；高濃度處理組幾乎觀察不到成熟精子，未成熟的精母細胞和精原細胞比例增加，出現大量細胞空泡化現象。

2.2 內參基因穩定性結果

GeNorm分析內參基因穩定性結果顯示，gapdh（2.02）>tuba1（1.22）>ef1a=β-actin（0.71），ef1a和β-actin的表達最穩定，gapdh的表達最不穩定（圖3（a））。NormFinder分析內參基因穩定性結果顯示，gapdh（1.85）>tuba1（0.84）>β-actin（0.78）>ef1a（0.25），ef1a的表達最穩定，gapdh的表達最不穩定（圖3（b））。Bestkeeper分析內參基因的穩定性結果顯示，gapdh（3.13）>β-actin（1.53）>tuba1（1.45）>ef1a（1.38），ef1a的表達最穩定，gapdh的表達最不穩定（圖3（c））。

根據上述3種方法對所有內參基因的分析評估，結果均顯示ef1a為MT暴露后稀有鮈鯽腦中最穩定的內參基因，因此本試驗選用ef1a為最終內參基因。

2.3 MT對稀有鮈鯽腦中KISS/GPR54系統基因表達的影響

2.3.1 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中kiss與GPR54表達的影響

MT處理稀有鮈鯽雌魚7、14和21 d，低濃度（25 ng·L-1）和高濃度（100 ng·L-1）MT顯著降低腦中kiss1基因表達量。MT暴露14 d，中濃度（50 ng·L-1）組kiss1基因表達量顯著升高（圖4（a））。MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，中濃度組kiss2基因表達量顯著升高，而高濃度組表達量顯著降低。延長處理至14 d，低濃度組kiss2基因表達量顯著升高，為對照組的10倍，而高濃度組的表達量顯著降低。延長處理至21 d，低濃度和高濃度組kiss2基因表達量顯著升高（圖4（b））。MT暴露稀有鮈鯽雌魚7 d，低、中、高3個濃度組GPR54β基因表達量顯著降低，延長處理至14 d，GPR54α和GPR54β基因表達量顯著降低，延長處理至21 d，GPR54α表達量均降低（P<0.05，圖4）。

圖3 MT誘導稀有鮈鯽腦內參基因的表達穩定值Fig. 3 Stability of reference genes in brain of G. rarus exposed to MT

圖4 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中kiss與GPR54基因表達量影響注：試驗結果表示為平均值±標準誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 4 Effect of MT on kiss and GPR54 genes in brain of female G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

2.3.2 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中kiss與GPR54表達的影響

MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，中濃度組腦中kiss1基因表達量顯著下降，而高濃度組表達量顯著升高（圖5（a））。低、中、高3個濃度組kiss2基因表達量顯著升高，其中50 ng·L-1MT對稀有鮈鯽kiss2基因表達的上調作用最為明顯，是對照組的11倍（圖5（b））。低濃度組腦中GPR54α基因表達量顯著升高。低濃度和高濃度處理組GPR54β基因表達量顯著升高。延長處理至14 d，中濃度組kiss1基因表達量顯著升高，而高濃度組的表達量顯著下降。低、中、高3個濃度組kiss2和GPR54α基因表達量顯著降低，高濃度組GPR54β基因表達量顯著升高。延長處理至21 d，低、中、高處理組kiss1基因表達量顯著升高，而GPR54β基因表達量顯著降低，中濃度處理組kiss2和GPR54α基因表達量顯著升高（P<0.05，圖5）。

圖5 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中kiss與GPR54基因表達量影響注：試驗結果表示為平均值±標準誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 5 Effect of MT on kiss and GPR54 genes in brain of male G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

2.3.3 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中miRNAs表達的影響

MT處理稀有鮈鯽雌魚7 d，低濃度組miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達量均升高，而中濃度組和高濃度組表達量均降低，低濃度組miR-324-3p表達量顯著降低。延長處理時間至14 d，低濃度組miR-25-3p和miR-92a-3p表達量升高，而中濃度組和高濃度組miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達量均降低，miR-324-3p表達量無顯著變化。延長暴露時間至21 d，低濃度組miR-25-3p、miR-92a-3p和miR-137-3p，中濃度處理組miR-137-3p和高濃度處理組miR-25-3p、miR-92a-3p和miR-137-3p表達量均顯著下降，中濃度組miR-324-3p表達量顯著升高（P<0.05，圖6）。

2.3.4 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中miRNAs表達的影響

MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，低濃度組miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p表達量顯著升高，miR-25-3p表達量顯著降低。中濃度和高濃度處理組miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達量均降低。延長處理至14 d，miR-25-3p和miR-137-3p在低濃度和中濃度處理組均顯著上升，miR-92a-3p和miR-199-3p均無顯著變化，高濃度處理組4個miRNAs表達量均顯著下降，miR-324-3p在低濃度和高濃度組中表達量顯著升高。延長暴露時間至21 d，除高濃度處理組miR-199-3p無顯著變化外，miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p在低、中、高3個濃度處理組中均顯著下降。中濃度處理組miR-324-3p表達量顯著降低，而在高濃度處理組中顯著升高（P<0.05，圖7）。

3 討論（Discussion）

3.1 MT對稀有鮈鯽性腺的影響

環境內分泌干擾物可以與性激素受體競爭性結合，妨礙內源性性激素與受體結合發揮作用，從而影響性激素正常生理功能[30]。本研究采用0、25、50和100 ng·L-1的MT暴露稀有鮈鯽7、14和21 d，隨著處理濃度和處理時間的變化，MT對稀有鮈鯽性腺的發育產生不同程度的抑制作用。MT處理7、14和21 d后，稀有鮈鯽雌魚卵巢都有不同程度的退化，且隨著暴露時間的延長和暴露濃度的升高，卵巢退化的程度逐漸嚴重，成熟卵細胞比例逐漸降低。研究表明，50 mg·kg-1MT投喂草魚（Ctenopharyngodonidella）30 d時卵巢中出現精原細胞，30～150 d卵巢受到更加嚴重的抑制作用，卵母細胞的生成和成熟受到抑制[31]。暴露MT后黑頭軟口鰷（Pimephalespromelas）和青鱂（Oryziaslatipes）卵巢退化和發育遲緩，與本研究結果一致[9]。因此，本研究和前人的研究結果表明MT可以抑制魚類卵巢的發育，阻礙生殖細胞的成熟。隨著暴露時間的延長和暴露時間的增加，成熟的精子逐漸減少，精巢退化程度逐漸嚴重。研究表明，以含體質量0.5%的MT日糧喂養牙鲆（Paralichthysolivaceus）幼魚，處理組的雄性率達到100%[32]，50 ng·L-1MT暴露麥穗魚和380 ng·L-1MT暴露青鱂雄魚后處理組中雄魚性腺均出現精卵巢（testis-ova）現象[9]。MT處理7 d后引起稀有鮈鯽雄魚性腺指數顯著降低，精巢發育受到抑制[33]。性成熟的鋸蓋魚（Centropomusundecimalis）注射MT后，0.3～30 mg·kg-1濃度范圍都可以促進精巢的生長和發育，加速精子的形成[34]。50 μg·L-1MT處理雄性鰻鱺（Anguillajaponica）45 d，性腺指數顯著升高，精巢發育受到促進，此時精巢中以精細胞為主[35]。因此，本研究和前人的研究結果都表明了MT可以影響魚類性腺發育，高濃度MT可以抑制魚類精巢的發育。

圖6 MT對稀有鮈鯽雌魚腦中kiss1相關miRNAs表達量影響注：試驗結果表示為平均值±標準誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 6 Effect of MT on kiss1 related miRNAs in brain of female G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

圖7 MT對稀有鮈鯽雄魚腦中kiss1相關miRNAs表達量影響注：試驗結果表示為平均值±標準誤；不同小寫字母表示顯著性水平（P<0.05）。Fig. 7 Effect of MT on kiss1 related miRNAs in brain of male G. rarusNote: The data were showed as mean±SEM; the different letters represented significant level （P<0.05）.

3.2 MT對稀有鮈鯽腦中KISS/GPR54系統的影響

KISS/GPR54系統在魚類個體生殖和發育過程中發揮重要作用[36]，在調控魚類生殖內分泌中系統發揮重要作用，不僅參與調節魚類青春期起始，參與調節魚類繁殖行為，使其表現出不同的生物學活性，還可以調節魚類季節性繁殖的生殖內分泌，調控魚類性腺發育，促進分泌GnRH和促性腺激素[37]。研究結果顯示，MT暴露稀有鮈鯽后，ef1a是腦中表達最穩定的內參基因，與雙酚A暴露稀有鮈鯽腦中穩定表達基因一致[28]。MT處理雌魚7 d和14 d，kiss2基因表達量均呈現先升高后降低的趨勢，延長處理至21 d，kiss1與GPR54α表達量均降低。MT處理稀有鮈鯽雄魚7 d，kiss1基因表達量先降低后升高，而kiss2基因表達量均顯著升高，延長處理至14 d，kiss1基因表達量先升高后降低，kiss2基因表達量則降低，延長處理至21 d，kiss1表達量均升高，而GPR54β則降低。表明不同濃度的外源性雄激素MT能夠改變稀有鮈鯽KISS/GPR54系統基因的表達模式，該系統在稀有鮈鯽個體生殖和發育過程中發揮重要的作用。大多數脊椎動物的研究報道指出KISS/GPR54系統結合HPG軸來調控GnRH的分泌和釋放，從而控制下游的促性腺激素的釋放和分泌[38-39]。在嚙齒動物的研究中，KISS/GPR54系統通過應答由雌雄激素引起的正負反饋調節來調控下游促性腺激素的釋放和分泌[40]。因此我們認為稀有鮈鯽HPG軸下游的調控機制與哺乳動物相似，KISS/GPR54系統發揮關鍵作用。

GPR54β可以直接在垂體水平或者通過性腺激素的反饋作用來調控促性腺激素的分泌。本試驗結果顯示，25、50或100 ng·L-1的MT處理7 d，可引起稀有鮈鯽雌魚腦中GPR54β基因mRNA的表達量顯著降低，我們推測MT通過抑制KISS與GPR54β的結合在垂體水平抑制下游激素的分泌，進而抑制稀有鮈鯽卵巢的發育，這與前人研究結果一致[27,39]。隨著稀有鮈鯽雌魚暴露時間延長至21 d，3個處理組與對照組表達量均無明顯差異，MT的抑制作用逐漸減弱直至消失，這可能是MT干擾卵巢類固醇激素合成，從而引起神經內分泌系統HPG軸的負反饋調節，使GPR54β基因表達恢復正常水平，進而恢復其原有生理功能狀態。這可能是機體在一定生理能力范圍內，為了適應不同環境狀態的一種生理補償效應[40]。

在硬骨魚類中，存在2種kiss基因分別為kiss1和kiss2以及2種GPR54基因分別為GPR54α（GPR54-2b）和GPR54β（GPR54-1b），且不同配體與受體之間能夠相互作用，信號傳導機制復雜多變，其不同的結合方式會導致其發揮不同的生理功能[41]。本研究發現，稀有鮈鯽雌魚腦內kiss1與GPR54α基因的表達模式相同，在稀有鮈鯽雄魚腦中kiss2與GPR54α的表達模式相同，因此，我們推測在雌魚腦內kiss1與GPR54α基因可能對外源激素MT有相同的應答模式，也有可能是配體與受體特異性結合形成配體-受體對共同發揮作用。在稀有鮈鯽雄魚腦中kiss2與GPR54α表達模式相同，可能對MT具有相同的響應模式，或者結合形成特異性配體-受體對。此結果與克氏雙鋸魚（Amphiprionclarkii）中的研究結果不同，克氏雙鋸魚腦和性腺中kiss1與GPR54-1b幾乎具有相同的表達模式，說明kiss1可能通過GPR54-1b作為配體-受體對參與克氏雙鋸魚的生理調節[42]。歐洲海鱸kiss1與GPR54α親和性較高，而kiss2與GPR54β親和性較高[43]。金魚kiss1與GPR54β親和性較高，而kiss2與GPR54α親和性也較高[44]。因此我們推測kiss與GPR54基因的表達模式具相關性，但在不同魚類中表達或調控方式不同，需要進一步深入研究KISS/GPR54系統參與魚類生殖的調控機制。

本研究中，MT對稀有鮈鯽雌雄魚腦中kiss1基因表達的上調作用分別為對照組為1.5倍和1.9倍，而kiss2基因表達的上調作用分別為對照組的10.4倍和11.0倍，因此，我們推測MT對稀有鮈鯽腦中kiss2基因表達的影響作用相對于kiss1基因影響較為明顯，這可能預示著稀有鮈鯽的KISS-2神經元相較于KISS-1神經元對外源性雄激素作用更加敏感，這與雌二醇處理雌性稀有鮈鯽和斑馬魚幼魚結果一致[27,45]。性成熟雌性斑馬魚（Daniorerio）和鱸魚（Lateolabraxjaponicus）研究中發現kiss2能在垂體水平較kiss1更顯著地促進KISS/GPR54系統下游基因FSHβ和LHβ的表達，這說明kiss2可能是激活促性腺激素合成的關鍵因子[43,46]。對歐洲舌齒鱸分別注射KISS-1和KISS-2，注射KISS-2血清中LH升高4倍，FSH升高2倍，而注射KISS-1血清中LH僅為正常的2倍，而FSH則無顯著變化[15]。上述試驗結果表明，稀有鮈鯽暴露于外源性雄激素MT環境中，kiss2可能是性腺激素反饋調控過程中KISS/GPR54系統中的主要執行者。

3.3 miRNA介導MT影響稀有鮈鯽腦中kiss1基因的表達

本研究結果表明，低濃度MT處理稀有鮈鯽7 d，雌魚腦中miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達顯著升高，kiss1基因表達顯著降低。miR-25家族的miR-25-3p和miR-92a-3p可以與kiss1基因的3’-UTR區結合，從而影響小鼠青春期的啟動以及動情周期[21]。在卵巢子宮內膜異位癥中miR-25-3p直接靶向轉錄因子特異性蛋白（Sp1）發揮作用[14]。miR-92a-3p通過調控B細胞易位基因2（btg2）調控乳腺癌細胞增殖和轉移[47]，通過靶向大腫瘤抑制基因2（lats2）影響宮頸癌細胞的增殖、凋亡和侵襲[48]。中樞性性早熟女童血清中miR-137的表達與kiss1呈負相關，且與LH峰值，基礎LH/FSH比值呈負相關[22]，本研究結果也顯示MT通過調控miR-137的表達進而影響kiss1的表達，進而影響稀有鮈鯽的性腺發育。

中濃度MT處理稀有鮈鯽7 d和高濃度MT處理稀有鮈鯽14 d，雄魚腦中miR-324-3p表達顯著升高，抑制kiss1基因表達，細胞學研究表明，miR-324-3p的過表達可以抑制kiss1的表達[49]。中濃度MT處理稀有鮈鯽21 d，雄魚腦中miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p表達顯著降低，kiss1基因表達顯著升高。將靶向miR-92a-3p的vivo-morpholinos（VMO）直接注射到斑馬魚卵巢中導致1細胞期胚胎中成熟miR-92a-3p的豐度顯著降低，以及發育停滯的胚胎比例顯著增加[50]。miR-199通過調控信號通路或靶向基因參與細胞增殖、分化和凋亡，miR-199-3p通過p38 MAPK途徑調節kiss1基因的表達，從而調控大鼠青春期的起始[24]。因此我們推斷中濃度MT處理稀有鮈鯽雄魚21 d，降低miR-92a-3p、miR-137-3p和miR-199-3p的表達，進而顯著升高kiss1的表達，從而干擾性腺發育。

綜上所述，我們推測MT通過調控miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p表達干擾kiss1基因的表達，進一步影響稀有鮈鯽性腺發育及卵細胞和精子的成熟。稀有鮈鯽kiss1基因表達受到miR-25-3p、miR-92a-3p、miR-137-3p、miR-199-3p和miR-324-3p等miRNAs的調控，有待進一步深入探究并驗證其靶向關系。同時我們發現稀有鮈鯽kiss2基因對外源性雄激素更加敏感，可以作為監測環境中MT的生物標志物。