稀土摻雜的上轉換納米材料的生物毒性與其作用機制研究進展

彭微，程嬌嬌，張凌燕,2，殷慧，孟穎，羅利霞,2,#，李淑榮,2,#，孟佩俊,2,*

1. 內蒙古科技大學包頭醫學院公共衛生學院，包頭 014040 2. 內蒙古自治區衛生檢測與評價工程技術中心，包頭 014040

稀土摻雜的上轉換納米材料（rare-earth-elements-doped upconversion nanoparticles, REEs-UCNPs）是稀土元素摻雜于晶體構成的納米顆粒發光材料，其基本結構由基質、激活劑和敏化劑組成，可以通過多層修飾制備出表面修飾配體不同的納米顆粒，具有代表性的核殼式稀土摻雜的上轉換納米材料的結構如圖1所示[1]。REEs-UCNPs融稀土與納米顆粒的獨特性于一體，可以在紅外光（980 nm）的激發下發出不同顏色的可見光或紫外光，與傳統熒光材料相比，具有發光強度高、熒光壽命長、激發能量低、組織穿透能力強、對機體組織損傷小和生物相容性好等特點[2-5]。近年來，REEs-UCNPs在生物成像、光動力治療、藥物傳輸、太陽能電池和衛生檢測等領域應用日益廣泛，另外，其在臨床醫學領域具有極大的潛在應用前景[6-11]。例如，2020年，Zhu等[5]用含孟加拉紅（RB）的殼聚糖/β-GP水凝膠修飾的UCNPs（NaYF4:Yb,Er）作為無創光化學封閉劑，利用其高穿透力的近紅外光實現了光化學組織粘合技術（PTB）無創修復損傷的跟腱組織，避免傳統技術綠光穿透時對切開皮膚暴露斷裂肌腱部位造成損傷。2021年，Xu等[6]利用NaCsWO3納米晶局域表面等離子體共振（LSPR）效應，即吸收近紅外光后能增強上轉換發光（upconversion luminescence, UCL），設計出NaYF4與NaYF4:Yb,Er修飾的NaCsWO3，應用到太陽能鈣鈦礦電池（PSCs）中，發光強度提高124倍以上。在指紋成像中，2020年，Lei等[7]合成的多殼層啞鈴形REEs-UCNPs，實現了控制單激活劑鉺（Er）離子在不同能級之間的能量遷移。利用激發波長從980 nm移動到808 nm時，材料的熒光發射從紅色切換到綠色的獨特光學特性，達到了同時成像指紋圖案和檢測指紋中爆炸物殘留。隨著REEs-UCNPs在各領域應用的日益廣泛以及納米毒理學的發展，其生物毒性或安全性逐漸引起研究者關注，目前對納米材料生物毒性研究較多的有金納米顆粒[12]、量子點[13]和碳納米材料[14]等，然而對于REEs-UCNPs這方面的研究與報道較少。本文對REEs-UCNPs在生物體內的吸收-分布-代謝-排泄、生物毒性、毒作用機制與影響因素等的現有研究報道進行了綜述，為合成安全可靠的REEs-UCNPs、拓展其應用以及生物安全性評價提供思路和參考依據。

1 REEs-UCNPs的吸收-分布-代謝-排泄（Absorption-distribution-metabolism-excretion of REEs-UCNPs）

圖1 NaGdF4:Yb,Er@NaYF4核殼式稀土摻雜的上轉換納米材料的結構示意圖和相應的透射電鏡圖[1]Fig. 1 Schematic of the core shell particles and corresponding TEM images of NaGdF4:Yb,Er@NaYF4[1]

研究REEs-UCNPs在生物體內吸收-分布-代謝-排泄對其生物安全性評價具有重要意義，為進一步進行毒性機制研究提供思路。動物實驗中，多數研究采用尾靜脈注射方式進行染毒，研究顯示血液中REEs-UCNPs多在肝臟、脾臟、心臟、腎臟和腦等器官中被吸收，但其主要作用的生物靶器官是肝臟與脾臟，并在24 h內能快速聚集[15-17]。有研究報道顯示，富含竇狀毛細血管的肝臟與脾臟的細胞內或細胞之間存在直徑為0.5～3.0 μm和50～80 μm的小孔和膜孔，可形成篩板，該結構對納米顆粒有高滲透性[16]。另外，生物體內的網狀內皮系統對REEs-UCNPs具有一定的清除作用，但當納米顆粒粒徑遠高于腎濾過閾值（5.5 nm）時，腎小球濾過受阻，因此納米顆粒更易于在肝脾臟中聚集[18]。例如，Li等[15]用釔（Y）含量代表聚乙二醇化UCNPs （PEG-UCNPs，其中UCNPs為NaYF4:Yb,Tm,Gd）在體內的分布，按照小鼠體質量15 mg·kg-1的劑量靜脈注射PEG-UCNPs，檢測其含量在30 d內的變化規律，肝臟與脾臟中Y的含量在注射1 h后迅速升高，第7天仍較高，30 d后幾乎檢測不到；腎臟和肺的則是24 h后升高，第7天后顯示下降，30 d后腎臟幾乎檢測不到，肺中可檢測到較低的Y含量，結果表明PEG-UCNPs在全身各臟器均有分布，總體來說肝臟與脾臟的分布量相對最高，且脾臟多集中在紅髓。而Chen等[19]研究了小鼠尾靜脈注射PEG、聚醚酰亞胺（PEI）與葉酸（FA）修飾的多模靶向造影劑UCNPs（NaLuF4:Gd,Yb,Er）24 h與18 d后的體內分布情況，結果顯示，與其他組織相比，肝臟中的REEs-UCNPs在這2個時間點均最高，約87%聚集在其中。與大多數臨床藥物一樣，對REEs-UCNPs清除的研究主要集中在肝膽排泄系統和腎臟排泄系統。研究顯示，分布于肝、腎和脾臟等器官中的REEs-UCNPs在一段時間后可從體內排泄，其排泄速度與REEs-UCNPs的表面修飾配體無關[20]，但排泄途徑受REEs-UCNPs的粒徑與修飾配體的影響[15]。Seo等[21]的研究表明，粒徑比腎小球孔大的REEs-UCNPs開始會保留在肝臟與脾臟內，在肝臟中的REEs-UCNPs可被庫普弗（Kupffer）細胞與肝細胞吞噬，最終排泄出。Li等[15]的研究表明，可被巨噬細胞吞噬的PEG-UCNPs在肝臟中的清除率大于脾臟。同樣，Tian等[20]用PEG、D-SP5肽和凝集素-I（UEA-I）修飾的UCNPs@SiO2（UCNPs為NaErF4: Yb@NaYF4: Yb@NaNdF4:Yb@NaGdF4: Yb）進行了代謝相關實驗，結果表明，REEs-UCNPs主要由肝臟清除。

2 REEs-UCNPs的生物毒性（Biological toxicity of REEs-UCNPs）

目前，有關研究REEs-UCNPs生物毒性的報道較少，且現有的研究多為急慢性毒性試驗，少見特殊毒性試驗。多數研究結果顯示，在應用劑量內REEs-UCNPs是相對安全的。2017年，Feng等[22]的研究表明，在PEG修飾的REEs-UCNPs（Ba2GdF7:Yb,Er）30 d慢性毒性試驗中，該材料對血細胞未造成破壞，對F1小鼠各器官（脾、心、肺、腎和肝）的組織損傷可忽略不計。Li等[23]用聚吡咯（PPy）、DNA與多柔比星（Dox）修飾的REEs-UCNPs，按照9.4 mg·kg-1的劑量處理Balb/c裸鼠1、7和30 d后，與空白對照組比較，實驗組組織未見明顯損傷，血清生化檢測的5項重要的肝功能指標（丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（T-Bil）、總蛋白（TP）和白蛋白（ALB））和2項腎功能指標（肌酐（CREA）和尿素（UA））均在正常值范圍內。Tian等[20]用4種配體修飾（COOH、PEG、D-SP5、UEA-I）的UCNPs@SiO2（UCNPs為NaErF4: Yb@NaYF4: Yb@NaNdF4:Yb@NaGdF4: Yb）評價Balb/c小鼠的長期體內毒性，發現在靜脈注射30 d后，各實驗組小鼠的體質量未見明顯下降，其主要臟器（如心、肝、脾、肺和腎）未表現出明顯異常或損傷，血液生化分析表明，實驗組和對照組之間無統計學差異。2019年，Guryev等[16]用聚馬來酸酐（PMAO）與錨蛋白重復蛋白（DARPin）9_29修飾的UCNPs（NaYF4:Yb,Er,Tm/NaYF4）進行一般毒性與特殊毒性試驗，腹腔與靜脈注射UCNPs的小鼠與大鼠的急性毒性試驗結果顯示，未對大小鼠造成一定毒性影響；大鼠14 d慢性毒性試驗顯示，UCNPs對器官和組織未造成毒性影響與形態學改變；特殊毒性試驗結果表明，UCNPs對大鼠的生殖功能無不良影響，對小鼠無不良致突變活性，但可中度抑制小鼠細胞免疫。

在對REEs-UCNPs的生物毒性研究中，也有部分實驗結果表現出炎性反應與組織功能破壞等現象，甚至造成動物死亡。2018年，Yu等[24]通過比較不同濃度的UCNPs對ICR小鼠造成的急性毒性影響，發現用配體（Pro、Nle、Bpa、Leu和NPY）、DSPE-PEG和光敏劑MC540修飾的UCNPs （LiLuF4:Yb,Er@nLiGdF4@mSiO2）在200 mg·kg-1劑量時可使實驗組ICR小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達增加，造成輕度炎癥反應，同時小鼠肝切片出現肝細胞腫脹、破裂與細胞核消失等病理損傷。2019年，Chen等[19]用PEG、PEI與FA修飾的UCNPs（NaLuF4:Gd,Yb,Er）進行不同濃度急性毒性試驗，血液生化試驗結果顯示，白蛋白與膽堿酯酶（CHE）含量略有下降，表明小鼠肝實質受到輕微損傷；組織病理分析結果顯示，隨著劑量增加（10～100 mg·kg-1）小鼠的肝臟損傷更嚴重，表現為肝細胞逐漸出現彌漫性水腫、胞漿疏松、半透明與輕度充血，UCNPs染毒劑量為70 mg·kg-1與100 mg·kg-1的小鼠肺泡壁輕度增厚充血，100 mg·kg-1組的小鼠還表現出腎小管彌漫性增厚的病理改變，甚至出現死亡現象。

上述實驗多是采用靜脈或腹腔注射的方式探討REEs-UCNPs對動物的毒性影響。2019年，Lay等[25]使用秀麗線蟲進行了為期5 d的生殖孵卵試驗，評估了UCNPs（α-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4）的生物相容性和機械敏感性，結果顯示實驗組與對照組間沒有差異，初步認為消化道中UCNPs的攝取和積累不會影響蠕蟲的生存。

3 REEs-UCNPs的毒作用機制及其影響因素（Toxic mechanism and influencing factors of REEs-UCNPs）

目前，關于REEs-UCNPs的毒作用機制主要集中在細胞層面，有研究顯示，REEs-UCNPs與細胞模型的相互作用可造成氧化應激、細胞膜受損與通透性改變、細胞核形態與功能改變、內質網應激等病理改變，進而導致細胞死亡或活性下降。不同類型、大小、濃度、反應時間的REEs-UCNPs處理對各種細胞模型存活率的影響如表1所示。REEs-UCNPs的安全問題會對其實際應用造成一定影響，但與量子點（quantum dots, QDs）等多數納米顆粒的體內外毒性研究類似，其毒作用與化學組成、表面修飾配體、電荷分布、粒徑和所在體系中的濃度與穩定性有關。不同因素引起REEs-UCNPs的毒性效應及其毒作用機制不同。

表1 稀土摻雜的上轉換納米材料與細胞孵育后的細胞活力Table 1 Cell viability after incubation with rare-earth-elements-doped upconversion nanoparticles

3.1 修飾配體對REEs-UCNPs毒作用的影響

REEs-UCNPs的應用有其獨特的一面，表現在為了改變其功能常對其進行表面配體修飾以結合不同類型官能團，且在生物緩沖液中具有良好的分散穩定性和生物相容性[31]。如通過修飾PEG提高其生物相容性，修飾PMAO與十八烯（ODE）增加水油相的兩親性等。諸多研究顯示，REEs-UCNPs表面是否有配體修飾以及修飾配體的種類對其生物毒性的影響呈現出不同的效果。無配體修飾的REEs-UCNPs釋放的稀土離子和磷酸基團相互作用會導致ATP失活，進而導致細胞凋亡與自噬，損傷細胞的清除使機體呈現炎癥反應[32-33]。2018年，Chen等[33]的研究表明，REEs-UCNPs（NaYF4:Er與NaGdF4:Yb,Er）可導致輕微腎炎和肝臟毒性。Xu等[34]研究發現，不同濃度（25、50、100、200、400和800 μg·mL-1）的REEs-UCNPs（NaGdF4:Yb,Er,Mn@NaGdF4:Yb）對人肝癌細胞僅呈現低細胞毒性。現有研究表明，相同基質材料的REEs-UCNPs往往也會呈現不一樣的細胞毒性，與其處理時間、濃度與染毒細胞種類等因素有關。Rafique等[35]研究的NaYF4:Yb,Er的REEs-UCNPs在高劑量（700 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1）染毒人肝癌細胞株（HeLa、A549）、小鼠腫瘤細胞株（SCC7）和正常人細胞株（Hek293）12 h后，細胞活力受到抑制[35]。Guller等[36]對相同材料的REEs-UCNPs染毒（劑量為125 μg·mL-1）人角質形成細胞（Hacat）120 h后，細胞存活率下降可忽略不計。

不同表面修飾配體的REEs-UCNPs的分散穩定性與生物相容性是不同的，不僅影響材料本身的光學特性，而且會改變材料表面電荷及其流體動力學直徑，進而改變細胞對其的攝取量，影響細胞活力、增殖等[31,37]。例如，聚（低聚（乙二醇）甲基醚丙烯酸酯）-嵌段-聚（單丙烯氧基乙基磷酸酯）（POEGA-b-PMAEP）涂層修飾的REEs-UCNPs可造成細胞亞致死效應，細胞核表現出一系列應激變化，如細胞核有輕微形態改變，核仁C23與B23的豐度出現輕微變化[38]；PMAO和PEI修飾的REEs-UCNPs可造成細胞形態的異常改變、Ca2+活性的降低和細胞的死亡[39]；聚乙二醇二縮水甘油醚（PEG-DGE）修飾的REEs-UCNPs對細胞具有中度毒性作用，表現為生存能力下降和神經元-神經膠質網絡功能活性的顯著變化[40]。然而，2020年Liu等[41]的研究表明，DNA與金納米粒子修飾的REEs-UCNPs的細胞毒性可忽略不計。

3.2 表面電荷對REEs-UCNPs毒作用的影響

眾多研究顯示，REEs-UCNPs表面電荷的變化會影響其與細胞的相互作用。REEs-UCNPs表面電荷（電位值）不僅受修飾配體的影響，也與其所處的基質密切相關。例如，細胞培養液中的REEs-UCNPs會吸附蛋白質，對其表面電荷影響很大[42-43]。2015年，Zhang等[37]研究發現，UCNP@SiO2-PEG和UCNP@SiO2-PEG-NH2的電位值被PEG表面配體修飾后發生了顯著變化，在培養基中孵育前與孵育后也可導致其電位值大小前后不同，電位值的變化進一步影響REEs-UCNPs在培養體系中的細胞內化率與流體動力學直徑，其中，帶正電荷的UCNP@SiO2-PEG-NH2比帶負電荷的UCNP@SiO2-PEG與UCNP@SiO2-COOH更易通過內吞作用進入細胞，因此其細胞攝取量更大，進而毒性增加；而內吞量小的UCNP@SiO2-PEG毒性大于UCNP@SiO2-COOH的原因是帶電荷的強弱不同，帶弱電荷的UCNP@SiO2-PEG在培養體系中會增大流體動力學直徑導致細胞內化率低，細胞免疫反應強，進一步導致毒性較大。由于帶正電荷的REEs-UCNPs易于被細胞靜電吸引靠近，進而內吞進入細胞的量增加，2018年，Guller等[36]的研究顯示，同為帶正電荷的UCNP@PEI@Dx與UCNP@PEI的毒性大于帶負電荷的UCNP，對細胞有明顯損傷作用。2019年，Lay等[25]在秀麗線蟲模式生物研究中，同樣發現帶正電荷的REEs-UCNPs更容易被咽部組織細胞內吞。

3.3 粒徑對REEs-UCNPs毒作用的影響

近年來的諸多研究表明，稀土納米顆粒的生物毒性與其粒徑息息相關，不同粒徑的稀土納米顆粒會引起不同的細胞反應。Semashko等[44]的研究表明，培養體系中的稀土納米顆粒平均流體動力學直徑不僅與其濃度有關，也與其培養體系密切相關；在不同培養體系中的稀土納米顆粒，會與吸附的蛋白質、碳水化合物和電解質等分子相互作用，進而會形成高度復雜的電暈，導致在培養體系中形成不同粒徑的顆粒，平均粒徑在55 nm以上的稀土納米顆粒不會對細胞生長產生任何影響，只有極小尺寸的納米顆粒才能真正參與腫瘤的生長。然而，Chen等[33]的研究顯示，粒徑大的稀土納米顆粒更容易被滯留在體內，比相對較小的納米顆粒更易引起炎癥反應，表現在白細胞數量增多。另外，2020年，Wang等[45]的研究顯示，盡管粒徑為35 nm的聚（丙烯酸）修飾的稀土摻雜的上轉換納米顆粒（PAA-REEs-UCNPs）的細胞攝取量高于粒徑為55 nm的PAA-REEs-UCNPs，然而后者的清除速度較前者減慢，這在一定程度驗證了Chen等[33]的研究結果。可見REEs-UCNPs粒徑對生物體的影響是雙向的。

4 總結與展望（Conclusion and prospects）

REEs-UCNPs由于其獨特的光化學特性，其應用日益廣泛。目前，REEs-UCNPs的生物學毒性效應以及對環境和人類健康的影響已經引起一部分研究者的關注。本文對近年來有關REEs-UCNPs的吸收-分布-代謝-排泄、生物毒性、毒作用機制與影響因素等方面進行了綜述。現有報道中，有關REEs-UCNPs生物毒性的實驗研究相對較少，且現有研究中多數實驗結果表明，在染毒劑量內，REEs-UCNPs對小鼠和大鼠組織未呈現出明顯損傷。但也有研究表明，REEs-UCNPs可導致動物出現炎性反應、組織功能破壞等現象，甚至發生死亡。關于REEs-UCNPs毒作用機制及其影響因素的研究，目前結果顯示，REEs-UCNPs對生物體的影響是復雜多變的，且各影響因素之間存在相互作用，例如，REEs-UCNPs表面電荷的變化受培養體系與表面修飾配體等因素的影響，同時其也可導致REEs-UCNPs的粒徑不同，從而多維度影響REEs-UCNPs的毒性作用。

綜上所述，目前對REEs-UCNPs的生物毒性研究缺乏系統性和全面性，且存在同樣研究表現出不一致的結果。因此，一方面對REEs-UCNPs的生物毒性的研究應該針對納米材料類型、表面修飾配體類型、納米顆粒大小、表面修飾電荷種類和數量等諸多因素在細胞層面和動物層面進行全方面立體式研究分析。第二，建立REEs-UCNPs分析檢測新技術深入了解其在亞細胞內和組織中的分布、代謝途徑、形態變化和降解規律等信息，為全面闡釋REEs-UCNPs在細胞和生物體內的變化規律提供依據。第三，結合基因組學、代謝組學和轉錄組學等技術進行多角度、深層次研究，為最終揭示REEs-UCNPs生物毒性機制和進行安全性評價提供依據。