外泌體非編碼RNA在胰腺癌診療應用中的研究進展

劉宗林 程春東 王擁衛

哈爾濱醫科大學附屬第一醫院胰膽外科 肝脾外科教育部重點實驗室，哈爾濱 150000

【提要】 外泌體是由細胞分泌的40～150nm的納米級囊泡，含有微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環狀RNA(circRNA)等多種非編碼RNA。越來越多的研究表明，來源于外泌體的非編碼RNA具有高度的穩定性和組織特異性，在胰腺癌的發生和發展中起著重要作用，同時，也可以作為指導胰腺癌臨床診斷和治療的特殊生物標志物。

近年來，外泌體由于在細胞功能方面的作用，特別是在腫瘤發生、發展過程中發揮的作用，引起了研究者越來越多的關注[1-3]。外泌體是由細胞分泌的納米級囊泡，大小為40～150 nm，其內包含DNA、RNA、脂質、蛋白質等血漿物質，廣泛存在于人的尿液、唾液、腦脊液中，通過進入受體細胞，傳遞信息，從而發揮介導細胞間通信的作用。外泌體參與免疫反應、呈遞抗原及RNA轉運、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等多種生物學過程。近年來越來越多的研究證實外泌體中的非編碼RNA在胰腺癌的診斷及治療中發揮重要的作用。本文就外泌體非編碼RNA在胰腺癌的診斷、預后判斷及治療等方面的潛在價值以及應用做一綜述。

一、外泌體的概述

外泌體是由johnstone等于1987年在體外培養綿羊網織紅細胞時發現的，起初人們認為外泌體僅僅是網織紅細胞在成熟過程中移除轉鐵蛋白受體的“排泄小泡”，直到近些年來隨著對外泌體研究的深入，其在細胞間的通信作用才逐漸被人們所認知。外泌體形成的最初階段是細胞膜向內凹陷形成核內體，核內體在成熟的過程中不斷地向內萌發，繼而形成含有腔內小泡的多泡小體，其內包含核酸以及可溶性蛋白質成分，多泡小體通過與細胞膜融合將外泌體由原細胞釋放到細胞質中。目前，內吞體分選轉運復合體被廣泛認為在外泌體的形成和分泌過程中發揮重要調節作用。除此之外，外泌體中的Rabs蛋白是外泌體與受體細胞融合過程中重要的調節因子。外泌體源性的非編碼RNA自身穩定性比較高，其分離、提取的方法通常根據外泌體不同的形態、密度、大小和表面蛋白標記而不同，目前主要有試劑盒法、超速離心法、超濾離心法、磁珠免疫法、交流電動微陣列芯片裝置法等，其中最為廣泛應用的是超速離心法和試劑盒法[4]。但以上方法均存在生產率不足、分離純度不高的問題。近年來，出現了一些新的外泌體分離方法，如微流控器件、納米等離子體增強散射、膜介導的外切體分離和芯片實驗室等。雖然缺乏實驗室測試經驗和臨床前實踐，但這些方法將有望提高外泌體的生產率以及純度。

二、外泌體非編碼RNA與胰腺癌的關系

1.外泌體非編碼RNA與胰腺腫瘤細胞增殖的關系：增殖失調是腫瘤轉化中最重要的因素之一，研究表明，外泌體非編碼RNA通過激活關鍵的信號轉導途徑在腫瘤細胞增殖中發揮重要的作用[5]。Li等[6]發現腫瘤產生的miR-222可以通過調控或重新等位p27來影響腫瘤細胞間的相互作用，進一步誘導附近的腫瘤細胞增殖。Fu等[7]的研究表明，外泌體來源的miR-98-5p表達降低不僅下調絲裂原活化激酶4(mitogen-activated protein kinase,MAPK4)進而促進胰腺癌細胞的增殖,而且激活了MAPK/ERK通路，該通路在腫瘤形成中至關重要。此外，Wang等[8]報道了外泌體miR-182通過靶向調節在細胞周期檢查點中發揮關鍵作用的pri-TrCP2，正向調控細胞的增殖能力，從而在胰腺癌的進展中起到重要的作用。一直以來，放療后腫瘤細胞加速再生被認為是導致治療失敗的重要原因之一[9]。Chen等[10]發現腫瘤細胞死亡后釋放出的外泌體刺激殘余腫瘤細胞重新增殖，而circRNA可能作為外泌體的重要物質參與腫瘤細胞的再增殖，外泌體circ0002130-外泌體miR4482-3p-NBN相互作用網絡提示潛在的海綿化miRNA和靶mRNA。最近，M2巨噬細胞被發現與胃癌和乳腺癌相關，其在胰腺癌的進展中同樣發揮作用。Yin等[11]發現,敲除M2巨噬細胞外泌體中的lncSBF2-AS1可促進miR-122-5p的表達，進而抑制其下游X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的表達，從而抑制胰腺癌細胞的增殖。這在一定程度上揭示了M2巨噬細胞外泌體源性的lncSBF2-AS1與胰腺癌相互之間的關系。

2.外泌體非編碼RNA與胰腺腫瘤細胞侵襲和轉移的關系：侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本特征，也是腫瘤復發、疾病惡化甚至最終死亡的病理基礎。胰腺癌具有高度的侵襲性和轉移性，這是胰腺癌治療效果差的主要原因。腫瘤細胞可以通過侵襲和轉移侵犯鄰近組織或者轉移到遠處，并在其他組織及器官中定植。外泌體非編碼RNA通過多種機制調控胰腺癌腫瘤細胞的自身生長及腫瘤微環境最終促進胰腺腫瘤細胞的侵襲和轉移。在衍生自胰腺腫瘤細胞的外泌體介導胰腺癌發展的進程中，含在外泌體內的非編碼RNA有助于腫瘤細胞的侵襲和轉移。有研究報道外泌體miR-21在胰腺導管腺癌腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)的表達中異常活躍，這無疑對胰腺癌腫瘤細胞的侵襲和轉移具有重要意義[12]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胰腺癌進展過程中的一個重要事件，EMT可以促進腫瘤細胞的局部浸潤以及遠處轉移[13]。研究發現，通過敲減外泌體miR-429和外泌體miR-141的表達可以抑制胰腺癌腫瘤細胞的增殖和轉移，并同時提高了胰腺癌中EMT主要調控因子的表達效率[14]。Hu等[15]研究發現，雙特異性磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)是外泌體miR-361-3P的直接作用靶點，而DUSP2可以通過直接導致ERK通路的失活來參與miR-361-3P誘導的EMT，表明miR-361-3P在胰腺癌的EMT中發揮調節作用。Li等[6]發現從胰腺導管腺癌細胞分泌的外泌體中分離的lncRNA Sox2ot可通過充當競爭性內源RNA促進EMT。Ma等[16]發現胰腺星狀細胞來源的外泌體miR-21可通過Ras/ERK通路促進腫瘤細胞的遷移，并誘導實現EMT。此外，lncRNA Sox2ot過度表達與胰腺導管腺癌患者的腫瘤淋巴結轉移和總生存率相關，其表達水平在腫瘤切除后降低[17]。Li等[18]研究發現,外泌體circRNA(circ-PDE8A)的高表達與胰腺導管腺癌患者的淋巴管浸潤以及晚期TNM分期和不良的生存率相關，circ-PDE8A通過miR-338/MACC1/MET或AKT途徑促進胰腺導管腺癌細胞的侵襲性生長。血管生成是不同腫瘤細胞發生和發展過程中的又一重要事件，腫瘤細胞在生長的過程中，需要不斷形成新的血管來為腫瘤組織提供營養物質的供應。越來越多的文獻證明外泌體非編碼RNA在胰腺癌血管生成方面發揮重要作用。Shang等[19]研究發現，攜帶miR-27a的外泌體可以通過B細胞異位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)在胰腺癌中促進人微血管內皮細胞(human microvascular endothelial cell,HMVEC)的血管生成。

三、外泌體非編碼RNA在胰腺癌診斷及預后中的應用

胰腺癌早期缺乏特異性癥狀，而作為臨床常規篩查的腫瘤標志物CA19-9的靈敏度和特異度相對較低[20-21]。外泌體富含蛋白質、mRNA及非編碼RNA，可以充當細胞間RNA轉移的介質，保護其中的RNA不被RNA酶降解，從而確保血液循環中RNA的穩定性[22]，目前已開展大量關于外泌體提高胰腺癌早期發現率的研究，研究熱點為蛋白和非編碼RNA，其中非編碼RNA中的miRNA作為胰腺癌診斷和預后的生物標志物的潛力受到越來越多的關注[23]。

有學者檢測了49例患者(22例胰腺癌、6例胰腺良性腫瘤、6例慢性胰腺炎、7例壺腹癌)及8例健康對照者的血清外泌體miRNA，結果發現與健康對照組相比，49例患者miR-17-5p和miR-21表達明顯增高，其作為腫瘤標志物的靈敏度及特異度分別為72.7%、92.6%和95.5%、81.5%。同時該研究結果顯示miR-17-5p在轉移和晚期胰腺癌中表達增高，表明其可以作為不可切除胰腺癌患者的生物標志物[24]。同時在miR-10b、miR-550、miR-196a、miR-1246及miR-451a的研究中也得到相似的結果[25-28]。這些結果表明從胰腺癌細胞中分離的外泌體miRNA可以作為早期診斷胰腺癌的生物標志物。除了血清外泌體標志物外，唾液中外泌體miRNA在診斷胰腺癌方面也具有較大潛力。Machida等[29]在包括12例胰膽管癌患者和13名健康者的研究中發現，唾液外泌體miR-1246和miR-4644可以作為胰膽管癌早期生物標志物，靈敏度及特異度分別為66.7%、100%和75.0%、76.9%。

外泌體非編碼RNA在進行預后評估方面同樣具有較大潛力。有研究證實胰腺癌患者血清外泌體中miR-155異常高表達，且與胰腺癌患者無病生存期密切相關，同時與組織中miR-155具有高度相關性，提示外泌體miR-155可作為胰腺癌患者預后的評判指標[1]。Takahasi等[28]研究證實外泌體miR-451a在術后復發的胰腺癌患者中顯著增高，miR-451a高表達與胰腺癌患者的總生存期和無病生存期密切相關。上述研究主要集中在胰腺癌患者和健康人體外泌體的差異表達，及胰腺癌外泌體作為診斷和預后的生物標志物，外泌體是否可以用于評估胰腺癌治療效果還需要進一步研究。另外，外泌體非編碼RNA作為一種潛在生物標志物在臨床應用中仍存在許多障礙，如非編碼RNA穩定性問題，以及外泌體分離純化過程復雜的問題等。

四、外泌體非編碼RNA在胰腺癌治療中的應用

外泌體可由機體絕大多數細胞合成分泌，可攜帶蛋白質、DNA、RNA等物質進入細胞內，同時外泌體可以促進腫瘤的發生、發展和侵襲轉移等生物過程，故調控外泌體內的物質可在腫瘤治療方面發揮較大潛力。目前關于外泌體在胰腺癌治療中應用的研究主要分為3類：(1)腫瘤相關免疫刺激物；(2)藥物載體；(3)治療靶點。而外泌體非編碼RNA在其中主要作為藥物載體及治療靶點。

有研究發現miR-506在胰腺癌組織中顯著降低，其直接靶向激活STAT3-BCL2-BECN1通路可誘導胰腺癌細胞自噬凋亡，抑制胰腺癌的生長和遠處轉移，而將外泌體miR-506作為腫瘤治療藥物運輸的載體，不但不會產生免疫排斥，而且可靶向運輸至胰腺癌細胞發揮其抗腫瘤功能[30]。眾所周知，吉西他濱是胰腺癌標準化療藥物，但其在胰腺癌患者中耐藥率較高。有研究表明外泌體miR-146在介導胰腺癌化療耐藥中發揮重要作用。該研究發現CAFs對吉西他濱具有耐藥性，CAFs在吉西他濱的作用下通過釋放miR-146陽性的外泌體作用于胰腺癌細胞進而誘導化療耐藥的形成，當加入GW4869(外泌體釋放抑制劑)抑制CAFs釋放外泌體后，胰腺癌細胞成活率顯著降低[20]。同時有研究發現miR-155表達增加，能誘導胰腺癌細胞化療耐藥的形成，獲得耐藥的胰腺癌細胞通過釋放miR-155陽性的外泌體介導周圍胰腺癌細胞化療耐藥的形成，這也為胰腺癌治療提供了新的靶點[1]。

五、不足與期望

外泌體非編碼RNA作為特殊的生物標志物應用于臨床胰腺癌的診斷及治療仍處于早期的研發階段，在其真正投入于臨床使用之前仍需解決存在的各種問題。難點之一是外泌體的提取方法，目前學術界還沒有被廣泛認可的統一的外泌體提取方法。其二，目前對外泌體非編碼RNA的研究大多集中在表達水平的差異上，而對其分子功能的研究相對較少。其三，尚有大量的外泌體非編碼RNA沒有被發現，仍需更多的實驗研究來證明哪些外泌體非編碼RNA可作為胰腺癌的生物標志物。

綜上所述，外泌體非編碼RNA作為當下的研究熱點，為胰腺癌的早期臨床診斷及治療提供了新的方向，外泌體非編碼RNA已經成為潛在的生物標志物，為胰腺癌的治療提供新的靶點。同時，外泌體非編碼RNA將有望作為一種創傷性小并且特異度和靈敏度均較高的檢測指標，在未來胰腺癌的無創診斷、治療靶點的選擇及預后的判別上發揮更大的作用。

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