微小RNA在胰腺癌診斷中的研究進展

謝雨婷 高軍

海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200433

【提要】 微小RNA(miRNA)是由20～22個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，參與基因表達調控，其異常表達與胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移密切相關，提示miRNA有望成為胰腺癌診斷的生物標志物。

微小RNA(MicroRNA,miRNA)為真核生物核DNA編碼的內源性非編碼小RNA，是由20～22個核苷酸組成的單鏈聚合物，它們與調控細胞增殖和凋亡的靶信使RNA(messenger RNA,mRNA)的互補序列結合，主要在基因表達的轉錄和轉錄后調控中發揮致癌或抑癌的作用[1-4]。目前研究發現miRNA的抑制或上調與胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移密切相關，因此miRNA有望成為胰腺癌診斷的生物標志物。本文就其在胰腺癌診斷中的研究進展進行綜述。

一、miRNA在胰腺癌中的作用機制

miRNA可以靶向數百種不同的mRNA，一種mRNA也可以成為眾多miRNA的靶標[5]。miRNA通過與mRNA的3′UTR處的多個靶標結合，誘導翻譯抑制或轉錄本降解，而這取決于miRNA分子與靶標mRNA之間的互補程度[6]。miRNA在幾乎所有生物過程中都顯示出廣泛的調節活性，例如調節細胞生長、增殖、分化和凋亡等[7]。由于miRNA可以靶向癌癥相關基因，因此可作為致癌基因，促進腫瘤細胞增殖和(或)抑制細胞凋亡，或者作為腫瘤抑制因子，抑制腫瘤的發生[8]。研究表明，乳腺癌、神經膠質母細胞瘤、肝細胞癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌中都發現了一些表達異常的miRNA的[9]，因此通過分析這些特定的miRNA有助于腫瘤的診斷，同時還可以判斷腫瘤分期及患者的治療反應和預后等[9-11]。

miR-21是研究廣泛的miRNA之一，在神經膠質母細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、肝細胞癌等多種類型的腫瘤中顯著上調，還在腫瘤生長、侵襲和化學耐藥性的關鍵信號通路中起作用[12]。已被證實miR-21在胰腺癌中顯著上調[13-15]，并與腫瘤細胞增殖、轉移以及吉西他濱耐藥性有關[13,16-17]。更重要的是，在早期胰腺癌組織中即可檢測到miR-21[18]。此外，胰腺腫瘤細胞可通過誘導腫瘤相關成纖維細胞表達miR-21來提高其侵襲和轉移的能力[19]。

研究發現miR-148a在胰腺癌、肝細胞癌、胃癌和非小肺癌中顯著低表達，與腫瘤細胞侵襲性和患者較差的存活率相關。miR-148a主要作為轉移抑制因子，通過下調波形蛋白和上調E-鈣黏蛋白，在上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)中發揮關鍵作用[20-22]。SMAD2是轉化生長因子TGF-β信號轉導途徑中重要的腫瘤抑制基因，miR-148a通過調節SMAD2抑制TGF-β介導的EMT來抑制腫瘤轉移[23]，并可抑制光甘草定治療后的TGF-β/SMAD2信號通路來減弱腫瘤細胞自我更新、復制等特性[24]。研究報道，miR-148a在胰腺癌和胰腺上皮內瘤變組織樣本中的表達均受到抑制，且在胰腺上皮內瘤變中還觀察到miR-148a編碼區的DNA異常高甲基化，由此推測胰腺癌細胞中miR-148a的表達受抑制可能也是由于編碼區的DNA高甲基化[25]。Liffers等[26]通過胰腺癌細胞的熒光素酶報告基因分析觀察到細胞分裂周期25B重組蛋白(CDC25B)是miR-148a的潛在靶標。此外，通過基于慢病毒介導的miR-148a在IMIM-PC2胰腺癌細胞系中過表達的體外模型，他們證明了miR-148a過表達對胰腺癌細胞生長潛力具有抑制作用。多項研究證明，miR-148a過表達在不同的胰腺癌模型中均產生顯著的抗腫瘤活性[27-29]。

研究表明miR-217具有腫瘤抑制功能。miR-217低表達可促進腫瘤細胞運動和增殖，增強腫瘤侵襲能力[30-31]。Zhao等[32]分析了胰腺癌患者正常胰腺組織和腫瘤組織以及胰腺癌細胞系中的miRNA表達譜，與正常胰腺組織相比，miR-217在胰腺癌組織和細胞系中表達均顯著下調，過表達miR-217后則可顯著抑制細胞生長，且與 KRAS基因表達呈負相關。此外，對胰腺癌小鼠模型注射miR-217表達載體治療后，觀察到腫瘤體積變小，腫瘤生長受抑制，提示其具有治療胰腺癌的潛力。

miR-23a位于致癌的miR-23a/24/27a簇中，其在胃癌中高度過表達，促進癌細胞的生長[33]。在結直腸癌干細胞的miRNA表達譜中，miR-23a表達最高，miR-23a過表達可抑制轉移抑制因子1，從而促進結直腸癌細胞遷移和侵襲等[34-35]，而抑制miR-23a表達則會抑制上述病理過程。Liu等[36]報道，miR-23a在6種體外胰腺癌模型中差異性上調，miR-23a過表達與抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的凋亡蛋白酶激活因子1 表達水平降低相關聯，表明了miR-23a在胰腺癌中同樣具有致癌作用。

二、miRNA在胰腺癌診斷中的作用

1.胰腺組織標本中miRNA的表達：胰腺內可疑腫塊的組織學評估通常需要通過對原發腫塊或其轉移灶進行活檢，但獲得的組織量少且常有炎癥性改變，因此容易漏診且良惡性疾病難以鑒別。而miRNA具有較高的穩定性，可以在極少量組織和炎癥性改變的樣本中被檢測到。Bloomston等[37]分析了1 100多個miRNA在正常胰腺、慢性胰腺炎和胰腺癌組織中的表達，發現90%的標本中有21個高表達的miRNA和4個低表達的miRNA能正確區分胰腺癌和正常胰腺組織，15個高表達的miRNA和8個低表達的miRNA將胰腺癌與慢性胰腺炎區分開來，準確率為93.0%。Schultz等[38]在170例胰腺癌和107例壺腹腺癌組織中分析了miRNA作為診斷腫瘤生物標志物的潛在作用。他們評估了664個miRNA的表達，發現84個miRNA在胰腺癌和正常胰腺組織之間差異表達，其中胰腺癌組織中43個miRNA表達上調，41個miRNA表達下調。此外，與慢性胰腺炎相比，胰腺癌組織中17個miRNA表達上調，15個miRNA表達下調。該研究采用19個miRNA對胰腺癌和壺腹腺癌與慢性胰腺炎和正常胰腺組織進行鑒別診斷，其靈敏度為98.5%，準確率為97.0%，陽性預測值為97.8%。Xue等[39]對胰腺腫瘤切除標本中的miRNA表達進行了分析，結果顯示相比于正常胰腺組織，胰腺上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級及胰腺癌組織中的miR-148a、miR-217表達水平下調，miR-196表達水平顯著上調。此外，他們還檢測到miR-21在胰腺癌中過表達，miR-10b在胰腺上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級中高表達。Yao等[40]通過公共數據集篩選出胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織中差異表達的基因，并對其功能和信號通路進行了富集分析，發現6個靶向間質上皮轉化(mesenchymal epithelial transition，MET)因子的miRNA(miR-1-3p、miR-31-5p、miR-340-5p、miR-23b-3p、miR-34a-5p和miR-130a-3p)，其中miR-1-3p、miR-23b-3p、miR-34a-5p、miR-130a-3p具有MET的保守結合位點，可以通過PI3K/AKT信號通路靶向MET，從而影響胰腺癌的進程，提示這4個miRNA可以作為MET/PI3K/AKT途徑的上游調節劑，并有望成為胰腺癌患者診斷的生物標志物和治療靶標。

2.血清中miRNA的表達：雖然組織樣本中的miRNA可能有助于診斷胰腺癌，但是對于胰腺癌的早期診斷來說，血清中miRNA的實際應用可能更為廣泛。敏感、無創且易于獲得的血清miRNA檢測具有巨大潛力，有望成為胰腺癌患者的新型篩查方法。目前已報道與胰腺癌相關的血清miRNA主要有miRNA-18a、miRNA-16、miRNA-196a、miRNA-221、miRNA-223、miR-1290、miR-1246等，為血清miRNA作為分子標志物應用于胰腺癌的早期診斷和患者預后判斷提供了參考。Morimura等[41]將36例胰腺癌患者和30名健康志愿者的血清miRNA進行了比較，結果發現胰腺癌患者血清miR-18a濃度顯著高于對照組(P<0.0001)；胰腺癌患者術后血清miR-18a水平明顯低于術前(P=0.0077)；原發性胰腺癌組織中miR-18a水平與血漿中的水平相當。Liu等[42]用實時熒光定量PCR技術檢測了140例胰腺癌、111例慢性胰腺炎患者和68名健康對照者血清中miR-16、miR-21、miR-155、miR-210、miR-181a、miR-196a、miR-181b的水平。與慢性胰腺炎組和健康對照組相比，胰腺癌組7種miRNA的表達均顯著上調。此外，miR-16、miR-196a和CA19-9三者聯合應用在鑒別胰腺癌和非胰腺癌以及胰腺癌與慢性胰腺炎方面更有效。Kawaguchi等[43]比較了47例胰腺癌患者和30名健康志愿者的血清樣本，發現胰腺癌患者血清miR-221水平顯著高于健康者(P<0.0005)，術后血清miR-221水平顯著降低(P=0.018)，且術前血清中miR-221濃度高的胰腺癌患者與腫瘤轉移和不可切除性顯著相關。此外，有研究比較了71例胰腺癌患者與67名健康者的血清miR-223水平，發現胰腺癌患者血清miR-223水平顯著高于健康對照者(P<0.0001)[44]。Zou等[45]從129例胰腺癌患者和107名健康對照者的血清樣本中提取了miR-7b-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-25-3p、miR-192-5p和miR-223-3p，發現這6種miRNA鑒別胰腺癌患者與健康者的靈敏度為95.3%，特異度為76.7%。Wei等[46]通過對3個獨立的GEO數據集進行綜合分析，選擇了兩個上調的miRNA(miR-1290、miR-1246)，然后在120例胰腺癌、40例胰腺良性疾病患者和40名健康對照者中進行驗證。結果表明，胰腺癌患者的血清miR-1290和miR-1246表達水平升高，且在腫瘤切除后顯著降低(P值<0.001)；miR-1290的AUC大于miR-1246、CA19-9(0.91比0.81、0.82)，相比于單獨用CA19-9，CA19-9結合上述單個或兩個miRNA更容易將胰腺癌患者與正常對照者鑒別開來。提示血清miR-1290、miR-1246或許可以成為胰腺癌診斷的生物標志物，CA19-9與miR-1290或miR-1246的聯合檢測可以提高診斷胰腺癌的準確率。

3.糞便中miRNA的表達：由于糞便中存在不斷脫落壞死的細胞，因此糞便可能也是一種潛在的生物樣本，用于檢測其中的miRNA作為診斷胰腺癌的生物標志物。Link等[47]發現，與對照組相比，胰腺癌患者糞便樣本中miR-196a、miR-216a、miR-143的表達水平較低。在另一項研究中，胰腺癌組糞便中miR-181b和miR-210的表達水平顯著高于健康對照組[48]。Yang等[49]對30例胰腺癌、10例慢性胰腺炎患者和15名健康對照者的糞便標本進行研究，結果發現與慢性胰腺炎或健康對照者比較，胰腺癌患者miR-21和miR-155的表達水平較高，而miR-216的表達水平較低，提示糞便中的miR-21、miR-155和miR-216具有作為胰腺癌診斷標志物的潛力，但由于樣本量少，有待后續進一步研究。

4.尿液中miRNA的表達：血液中含有大量的miRNA，而尿液是血液經腎小球濾過和腎小管重吸收形成的，因此尿液中也存在miRNA。此外，尿液比血液更方便采集，無創且可大量采樣，便于檢測。Debernardi等[50]用RT-PCR技術分析了101份尿液樣本，其中包括46例處于不同疾病階段的胰腺癌患者、29例慢性胰腺炎患者和26名健康對照者的尿液。結果發現，與健康對照者比較，miR-30e、miR-143、miR-223在I期胰腺癌患者中顯著過表達(P值分別為0.022、0.035、0.040)；與Ⅱ～Ⅳ期胰腺癌患者比較，miR-143、miR-223、miR-204在Ⅰ期患者的表達更高(P值分別為0.025、0.013、0.008)；miR-223、miR-204在胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者間的表達差異有統計學意義(P值分別為0.037、0.036)。ROC曲線分析顯示，miR-143診斷Ⅰ期胰腺癌的AUC為0.862，靈敏度、特異度分別為83.3%和88.5%；miR-143和miR-30e聯合診斷I期胰腺癌的AUC為0.923，靈敏度、特異度分別為83.3%和96.2%。這提示了檢測尿液中miRNA有望成為診斷胰腺癌的一種無創便捷的方法。

5.胰液外泌體中miRNA的表達：胰液外泌體中包含了與腫瘤發生發展相關的蛋白質和miRNA等相關生物分子標志物，且這些外泌體中的miRNA(ex-miRs)可以免受內源性RNase活性的影響[51]。2010年Sadakar等[52]首次報道胰液中miR-21和miR-155的高表達可能是胰腺癌的潛在診斷標志物。Nakamura等[53]比較了胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者胰液外泌體中ex-miR-21、ex-miR-155的表達，發現胰腺癌患者兩者的表達顯著高于慢性胰腺炎患者，兩者聯合診斷胰腺癌的靈敏度、特異度和準確率分別為96%、75%和91%，比胰液細胞學診斷的靈敏度、特異度和準確率高，提示ex-miR-21和ex-miR-155的表達水平有助于胰腺癌與慢性胰腺炎的鑒別診斷。

6.唾液中miRNA的表達：近年來越來越多的研究證明唾液作為一種新型的液體活檢具有診斷和判斷預后的價值[54]。唾液中包含了多種蛋白質、DNA、mRNA、miRNA、代謝產物和微生物群[55]。與組織和血清樣本相比，唾液具有非侵入、無創傷、易于獲取和存儲、收集成本低等優勢，此外還具有可動態監控的功能，引起患者的不適感較小[56]。Humeau等[57]從7例胰腺癌、4例胰腺炎、2例胰腺導管內乳頭狀黏液瘤患者和4名健康對照者唾液樣本中分別提取了RNA，通過qRT-PCR篩選出94種miRNA的表達。結果顯示，胰腺癌患者唾液中的miR-21、miR-23a、miR-23b、miR-29c顯著上調，靈敏度分別為71.4%、85.7%、85.7%、57.0%，且具有極高的特異度(100%)；與健康對照者比較，胰腺炎患者唾液中的miR-210和miR-let-7c過度表達，靈敏度分別為100%和75%，特異度為100%和80%；與胰腺炎患者比較，胰腺癌患者唾液中的miR-216上調，靈敏度為50%，特異度為100%。提示唾液中的miRNA或許可成為診斷胰腺癌的生物標志物。

三、總結和展望

綜上所述，miRNA作為一種新型的胰腺癌診斷工具，其臨床應用還依然處于起步階段，缺乏與常規診斷方法的廣泛對比研究，但其具有無創、便捷、安全和相對廉價等優勢。此外，miRNA還具有很強的抗降解能力，在極少量組織或體液如血清、尿液等中即可定量檢測到其穩定表達，也利于該診斷技術的推廣。現階段miRNA診斷胰腺癌的基礎性臨床研究結果證實了其在胰腺癌診斷方面的巨大潛力，并能為胰腺癌的治療提供新的潛在靶點。但當前相關的臨床研究主要局限于較小樣本量的回顧性研究，還需要大型前瞻性研究加以證實，在擴大樣本量的同時比較不同方法對于胰腺癌診斷的準確率，尤其對于早期胰腺癌的診斷，最終將基于miRNA相關基因組學的胰腺癌診療流程在臨床工作中的規范化普及。有理由相信，miRNA將為胰腺癌的早期篩查診斷帶來新的曙光，未來給胰腺癌患者帶來更多的臨床獲益。

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