苦蕎查爾酮合成酶多克隆抗體制備及組織表達分析

李 蒙，陳 鵬

(1.西安文理學院 生物與環境工程學院，西安 710065；2.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

苦蕎(Fagopyrumtataricum)屬于雙子葉廖科1 a生草本植物，是重要的藥食同源作物，含有豐富的黃酮類化合物，其中蘆丁含量最高達80%[1]。黃酮類化合物不僅可使植物免遭病蟲、真菌、細菌的傷害[2-3]，而且可以預防癌癥、冠心病、中風等疾病[4-5]，對滿足當前人們營養需求具有重要作用，因此，苦蕎黃酮類化合物相關合成酶已經成為學者們研究的焦點。

苦蕎查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)是催化植物多酚類物質生物合成途徑的關鍵酶[6]。催化4-香豆酸-CoA(4-hydroxycin-namoyl-CoA)和丙二酰-CoA(malony-CoA)反應，生成花青素、原花青素等黃酮衍生物的起始底物柚皮素查爾酮(naringenin chalcone)[7-8]，為黃酮生物合成代謝提供基本的碳架結構、控制整個代謝的合成效率。目前CHS已經在較多物種中得到深入研究，不同物種中該基因盡管拷貝數不同但具有較高的同源性，多數植物還存在CHS基因家族[9]。研究表明，CHS在植物形成花色素的過程中扮演著重要作用[10-11]，對CHS基因進行RNA干擾從而降低花青素的含量，創造出白色牽牛花和3種不同顏色油點草花瓣[12-13]。同時，CHS在植物的生長過程中和抗生物脅迫等方面起著重要作用[14]。對蘋果的研究發現其基因沉默使葉片縮小和生長率降低，同時降低蘋果果實的黃酮含量[15]。近年來，轉錄組測序獲得了苦蕎黃酮類化合物合成過程中相關合成酶基因信息，從而篩選與驗證相關合成酶基因對苦蕎不同時期組織生長發育的影響[16]，為苦蕎在黃酮類化合物積累的品種改良和天然產物的開發與利用起到重要作用。

為進一步研究苦蕎黃酮類化合物的代謝機理，本研究通過FtCHS基因克隆，并結合基因重組表達技術，制備查耳酮合成酶的多克隆抗體，利用半定量RT-PCR和蛋白質印跡從轉錄和翻譯水平探究FtCHS在苦蕎各器官中的表達情況，為進一步闡明該基因在苦蕎黃酮類化合物合成過程中的生物學功能和分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

苦蕎種子(品系榆6-21，榆林農業學校提供)種植于西北農林科技大學試驗大田，開花3 d后采集灌漿期樣品種子、葉子、花、莖，立即分裝，液氮速凍于-80 ℃冰箱保存。原核表達載體pET-28a(+)、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)和TOP10均由西北農林科技大學生命科學學院化學與分子生物學實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 苦蕎總RNA的提取 采用Invitrogen公司的ConcertTMplant RNA Reagent從苦蕎種子中提取總RNA。

1.2.2FtCHS表達載體構建 根據苦蕎查爾酮合成酶(GenBank登錄號:KT284885.1)序列設計并合成引物，上游引物F1(5′-CCATGCCATGGGATGTGCATACATGGCTCCATC-3′，下劃線為NcoⅠ酶切位點)，下游引物R1(5′-ACACCGCTCGAGTTGAGCAACCACTGGTACACT GTGT-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點)，以反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，40個循環；72 ℃總延伸10 min。PCR產物經產物回收試劑盒(北京百泰克生物)純化，目的基因和質粒pET-28a(+)載體由NcoⅠ/XhoⅠ(Takara公司)進行雙酶切，純化目的基因經T4DNA Ligase連接到表達載體pET-28a(+)，連接產物轉化TOP10感受態細胞，經菌落PCR和質粒PCR鑒定，陽性克隆菌送北京奧科生物測序，重組質粒命名為pET-28a(+)-FtCHS。

1.2.3FtCHS生物信息學分析 測序結果應用Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行同源性分析；氨基酸序列比對應用Clustal X2和 genedoc軟件；應用ExPASy在線軟件對其等電點及分子質量預測；在線SWISS-MODEL三維建模；通過RNAfold在線分析mRNA翻譯起始區(-35～+39)二級結構及自由能分析；利用稀有密碼子在線分析軟件Rare Condon Calculator(RaCC)進行基因密碼子分析。

1.2.4FtCHS的表達 將鑒定的重組質粒pET-28a(+)-FtCHS轉化至表達菌株E.coliBL21(DE3)中表達。將構建好的表達載體接種到Kana(50 μg/mL)的LB培養基中，37 ℃培養至OD600達0.6～0.8時，加入IPTG至總濃度1 mmol/L，37 ℃誘導3 h,收集1.5 mL菌體，加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液懸浮菌體，沸水保溫10 min后離心取上清進行SDS-PAGE。

1.2.5TrCHS表達載體構建與表達 由于FtCHS未表達，截去蛋白質起始端83個氨基酸，截短蛋白中保留核心功能域，重新構建重組質粒pET-28a(+)-TrCHS的E.coliBL21(DE3)表達菌，重新設計上游引物F1(5′-CCATG CCATGG GA TGTGCATACATGGCTCCATC-3′，下劃線為NcoI酶切位點)，試驗過程同“1.2.2” 的FtCHS表達載體構建與“1.2.4”的表達方法，基因和質粒pET-28a(+)載體由NcoI/XhoI(Takara公司)進行雙酶切，純化目的基因經T4DNA Ligase連接到表達載體pET-28a(+)，將鑒定的重組質粒pET-28a(+)-TrCHS轉化至表達菌株E.coliBL21(DE3)中表達。

1.2.6 TrCHS的分離與純化 TrCHS蛋白的原核表達，參照文獻[17]方法進行，菌液以體積比1∶150接種到新鮮LB培養基(含有50 μg/mL抗生素kana)中，置于37 ℃振蕩培養，待菌液OD為0.6～0.8時加入IPTG誘導劑，使其終濃度為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1 mmol/L，分別置于37 ℃、30 ℃、25 ℃和22 ℃搖床中培養，離心管收集誘導后的菌液，8 000 r/min，低溫離心10 min，向收集的菌體(沉淀)中以約1 g(稱量去皮，濕質量)加入10 mL的超聲破菌緩沖液，取破碎樣品，12 000 r/min×10 min(4 ℃)，上清和沉淀進行蛋白電泳檢測。不可溶的包涵體經尿素復性后經鈷離子螯合層析柱純化，參照文獻[18]試驗方法，收集TrCHS菌體，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min×15 min，沉淀經30 mL 1×PBS(含6 mol/L尿素)混合，緩慢上樣經1×PBS平衡的Talon resin柱上，先用1×PBS(含6 mol/L尿素)洗脫雜蛋白，再用含20 mmol/L咪唑的PBS再次洗脫雜蛋白，最后用含150 mmol/L咪唑的PBS洗脫目標蛋白。目標蛋白經pH 8.0的透析液(50 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)透析后，再通過PEG 6000濃縮后，電泳檢測，-20 ℃保存。

1.2.7 TrCHS抗體的制備 鑒定的重組表達菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-TrCHS進行擴大培養，收集菌體，超聲波破碎，分離與純化后的目標蛋白質進行SDS-PAGE分析(蛋白質marker SM0431,Fermentas)，將凝膠用考馬斯亮藍R250染色。切取目的條帶，研磨后加入1 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.5)和弗氏不完全佐劑充分溶解[19]、混勻后，免疫大白兔(2～3個月)。首次免疫劑量為1 mg/只[20]，經背部皮下多點注射，每隔2周進行1 次加強免疫，4 次免疫之后，心臟穿刺取血，分離血清，Western blotting分析抗體的特異性，分別取1 g苦蕎葉、未成熟種子進行液氮充分研磨成粉末，加入10 mL蛋白提取緩沖液(10.0 mmol/L Tris-HCl 和25 mmol/L NaCl，pH 7.5)，室溫浸提1 h后12 000 r/min×10 min(4 ℃)離心，上清中含有苦蕎的總蛋白。以原核表達的融合蛋白為對照進行Western blotting，參照文獻[21]方法進行蛋白質印跡分析，-20 ℃凍存，備用。

1.3 FtCHS的組織表達分析

苦蕎不同組織中CHS的表達情況分析。FtCHS基因轉錄水平分析，提取種子、花、葉子、莖總RNA，設計FtCHS基因半定量RT-PCR引物，正向引物F1(5′-GAAGGCGACGAGGCAAGT-3′)，反向引物R1(5′-CGGTCCAAACCCGAACAAG-3′)，內參基因FtGAPDH正向引物F2(5′-AGTTGCACTACCAACTGCCTTG-3′)和反向引物R2(5′-AGGTCAACCACGGACACATC-3′)。以反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，28個循環；72 ℃總延伸10 min，擴增產物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。FtCHS基因翻譯水平分析，分別取1 g苦蕎葉、種子、花、莖組織中進行液氮充分研磨成粉末，加入10 mL蛋白提取緩沖液(10.0 mmol/L Tris-HCl 和25 mmol/L NaCl，pH 7.5)，室溫浸提1 h后離心，12 000 r/min×10 min(4 ℃)，上清中含有苦蕎的總蛋白。進行蛋白質印跡Western blotting方法分析。

2 結果與分析

2.1 FtCHS基因PCR擴增與載體構建

用設計的引物進行PCR擴增，擴增產物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示1 條特異性擴增片段(圖1)，與預期大小1 182 bp基本一致。重組表達載體經PCR擴增和基因測序，結果表明FtCHS基因全長1 182 bp，編碼393個氨基酸。

2.2 FtCHS序列分析

利用生物信息學在線軟件計算重組蛋白的等電點為6.06，理論相對分子質量約44.30 ku。二級結構預測結果顯示，α-螺旋占42.63%，β-轉角占6.58%，無規則卷曲占35.42%，延伸鏈占 15.36%，采用SWISS-MODEL三維結構同源建模(圖2)，其以同源二聚體形式存在，與擬南芥查爾酮合成酶的模型相似度為85.95%，結構分析表明其含有查爾酮合成酶高度保守的活性位點和標簽序列GFGPG。

2.3 TrCHS蛋白的誘導表達

重組質粒pET-28a(+)-FtCHS轉化表達菌E.coliBL21(DE3)，誘導后經SDS-PAGE分析，在35.0～45.0 ku未有明顯誘導表達條帶(圖3-A)，利用在線軟件對重組表達載體mRNA翻譯起始區二級結構與整體密碼子分析，結果發現，其翻譯起始區存在著穩定、復雜的莖環結構(△G=-46.89 kJ/mol)(圖3-B)，且AUG起始密碼子后有連續的稀有密碼子出現，導致FtCHS在E.coliBL21(DE3)中未表達。因此，經序列分析，截去蛋白質起始端83個氨基酸，截短蛋白中保留核心功能域，重新構建重組質粒pET-28a(+)-TrCHS的E.coliBL21(DE3)表達菌，誘導表達呈現明顯條帶，其大小與理論上的TrCHS分子質量約34.71 ku相符(圖3-C)，表明重組蛋白誘導表達成功。可溶性分析顯示，表達蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在。

2.4 TrCHS的純化與抗體制備

對純化后的TrCHS進行SDS-PAGE分析，結果表明(圖4)，鈷離子層析柱實現TrCHS的高效純化。為徹底除去可能存在的微量雜蛋白，凝膠染色后切取目標蛋白條帶，用于制備抗體。通過Western blotting分析抗體的特異性，結果如圖5所示，原核表達的目標蛋白、苦蕎未成熟種子和葉子的總蛋白都與抗血清雜交，顯示單一條帶，說明該抗體具有較高的特異性以及該基因所表達的蛋白質在苦蕎不同組織中也具有特異性。苦蕎葉子和種子的條帶略大于原核表達的TrCHS蛋白分子電泳條帶，符合預期試驗結果，表明苦蕎CHS特異性抗體制備成功。

2.5 組織表達分析

利用半定量RT-PCR方法對苦蕎不同組織FtCHS基因轉錄情況分析，以基因FtGAPDH為對照，結果表明(圖6)，苦蕎FtCHS基因在各組織中均有表達，其中葉子和種子中表達量明顯高于花和莖。利用制備的抗體進行Western blotting分析苦蕎不同組織中FtCHS的表達情況，結果表明(圖7)，FtCHS在各個組織中均有明顯表達，其中葉子、種子和花的表達量極顯著高于莖，而在葉子中的表達量明顯最高。

3 討論與結論

植物黃酮代謝路徑中CHS基因為多基因家族，屬于Ⅲ型聚酮合成酶[22]。其基因在進化過程中比較保守，但也發生了不同程度的重復和分化，導致不同植物基因組中出現數目和差異較大的拷貝數[23]，但蛋白質序列在不同植物中有較高的同源性，在氨基酸殘基、活性中心、反應機制和酶學性質上有著較高的相似性，但也存在功能上的差異性和多樣性[24]。FtCHS的氨基酸序列中底物結合口袋位點和環化反應口袋位點，可能起著篩選底物分子的作用及控制代謝流的方向，從而合成各種黃酮類化合物[25]。因此，探討苦蕎次生代謝物的累積與FtCHS的關系，研究該基因在苦蕎各器官中的轉錄與表達水平具有重要意義。本研究首先克隆FtCHS基因及生物信息學分析，發現FtCHS功能結構域有序排列分布，同源建模與擬南芥查爾酮合成酶的模型相似度極高，并以同源二聚體形式存在，為該酶結構與功能研究分析提供參考價值。

利用基因重組技術獲得目標蛋白質則成為基因與蛋白質研究的重要技術手段，可解決因目的蛋白天然提取量不足而導致研究受阻等問題，并且滿足目的基因在體外系統中穩定擴增和表達[26-27]。其中，外源基因在大腸桿菌中有效且大量表達是研究中的關鍵問題，影響外源基因表達的重要因素之一是翻譯起始效率，大腸桿菌中mRNA翻譯起始區(TIR)二級結構的穩定性直接影響核糖體的翻譯[28-29]。本研究通過重組載體pET-28a(+)-FtCHS轉化表達菌E.coliBL21(DE3)，誘導表達未出現明顯表達條帶，經mRNA翻譯起始區二級結構與密碼子分析，結果表明該翻譯起始區存在著穩定、復雜的莖環結構(△G=-46.89 kJ/mol)，且AUG起始密碼子后有連續的稀有密碼子出現導致FtCHS在E.coliBL21(DE3)中未表達。為了解決蛋白表達問題，本研究通過序列分析截去蛋白質起始端83個氨基酸，保留所有核心功能域，以此來降低pET-28a(+)-FtCHS的TIR二級結構的自由能，再構建pET-28a(+)-TrCHS的原核表達工程菌，成功純化目標蛋白。本研究再通過高純度目的蛋白免疫大白兔，成功制備出苦蕎查爾酮合成酶的抗體，并采用制備的抗體，首次在蛋白質水平上對查爾酮合成酶在苦蕎不同組織器官的表達情況進行了研究。特異性抗體的制備為苦蕎育種過程中黃酮類化合物在器官中合成、積累與監測等提供了有用的工具。

查爾酮合成酶是在植物次生代謝產物黃酮類物質合成途徑中的第一個關鍵酶，它在植物中表達量的改變，能夠影響黃酮類物質的代謝速率，比如調控花青素的空間表達及累積水平，直接影響花色[30]。目前，該酶在少數模式植物中研究的比較深入，而在其他植物中也獲得了大量的基因信息，但未能在轉錄和翻譯水平對其進行深入的研究，更不能大規模應用于花色改良和育種方向。本研究通過半定量RT-PCR方法對苦蕎不同組織中FtCHS基因轉錄情況分析，發現苦蕎FtCHS基因在各組織中均有表達，其中在葉子和種子中表達量明顯高于花和莖。通過Western blotting方法對苦蕎不同組織中FtCHS的表達情況分析，發現FtCHS在各個組織中均有明顯表達，其中在葉子、種子和花中的表達量極顯著高于莖，而FtCHS在葉子中的表達量明顯最高，推測苦蕎葉子和種子中高含量的黃酮類物質與FtCHS基因有直接關系[25,31]。外界因素對苦蕎查爾酮合成酶基因表達也具有調控作用，推測FtCHS基因可能參與抵御苦蕎逆境脅迫[32]，后續研究擬通過FtCHS功能鑒定研究其在苦蕎分子育種改良中的作用。本研究闡述了查爾酮合成酶的基因克隆與組織表達分析，旨在為進一步加強對查爾酮合成酶基因功能的發掘與利用，為苦蕎特色基因資源開發研究提供理論依據和思考 方向。