陜西榆林山藥根腐病病原菌的分離與鑒定

陳玉涵，馬心瑤，田夏夏，趙 杰

(西北農林科技大學 植物保護學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

山藥(DioscoreaoppositeThunb.)，又名薯蕷等多種別名，為薯蕷屬多年生藤本植物，常作 1 a生栽培[1]。山藥起源于中國，具有數千年的栽培歷史，在多地均有種植，包括5個主產區，分別為東北區、華北區、華中區、華南區、西北區[2]。目前，山藥廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶地區[3]。山藥既可用作中藥，也可用作蔬菜，具有藥用價值和經濟價值[4-5]。隨著山藥市場的不斷擴大，近年來山藥的種植面積一直都在穩步增加，據美國農業部(http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC)數據統計，2019年全世界山藥種植面積為891.05萬hm2，產量為7 432.15萬 t。

根腐病是危害山藥的一種常發性病害，發生較輕時造成20%的產量損失，嚴重時可達50%以上，甚至絕產[6]，已成為制約山藥生產的重要影響因素。山藥根腐病危害植株根莖部，發病初期表現為水漬狀，維管束呈褐色，后變為淺褐色至暗褐色，病部不縊縮，根部皮層出現腐爛，后變黑腐爛。根部腐爛造成植株地上部產生病狀，發病初期葉片黃化，嚴重時葉片干枯直至整株枯死[7-10]。

山藥根腐病可由多種病原菌引起。迄今，研究報道尖鐮孢山藥?；?FusariumoxysporumSchl.f.sp.dioscoreaeWellman)[10]、茄鐮孢[F.solani(Martins)Saccardo](原文名稱為腐皮鐮孢)[11]、厚垣鐮孢(F.chlamydosporumWollenw.& Reinking)[11]、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)[12]均可引起山藥根腐病。

榆林市地處陜西省北部，由于其沙質土壤，常年充足的光照等得天獨厚的地理條件，適合根莖類農作物的栽培種植[13]。該地區作為全國山藥產業傳統產區“北移西擴”的接續地，2013-2015年，從全國其他省(自治區)引入山藥品種20多個在該地區種植，發展山藥產業，并計劃在未來10 a內發展到一定規模，達到0.53～0.67萬hm2。近年來，在榆林市榆陽區一些山藥種植區陸續出現了危害山藥根部的腐爛病，已給一些種植戶造成一定的經濟損失。該病害也成為限制榆林山藥種植生產的重要因素，亟待研究解決，本研究旨在明確引起陜西省榆林市山藥根腐病的致病菌，以期為該地區山藥根腐病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試樣品 2020年9月于陜西省榆林市榆陽區一山藥種植戶田塊采集具有明顯發病癥狀的山藥塊莖以及病株周圍的土壤，帶回實驗室進行分離培養。同時采集健康山藥塊莖。

1.1.2 培養基 病原菌的分離培養使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g。培養基配制按常規方法進行[16]，將過濾后的馬鈴薯汁加入瓊脂和葡萄糖，在濾液中加入蒸餾水定容至1 L，于121 ℃滅菌 20 min，待培養基溫度降至50 ℃～60 ℃時，倒入滅菌培養皿，制作培養基 平板。

1.1.3 儀器設備 恒溫培養箱，離心機，PCR擴增儀、光學顯微鏡、超凈工作臺。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離與培養 參照常規真菌的組織分離與培養方法進行山藥根腐病的病原菌分離[14]。將患病的山藥塊莖用自來水沖洗干凈，在塊莖段病健組織交界處取樣,切成5 mm×5 mm的小塊，將病組織小塊浸入體積分數75%酒精溶液30 s后，使用滅菌過的鑷子取出，用滅菌水沖洗 3 次，再用滅菌濾紙吸干殘余水分后轉移到PDA培養基平板上，每個平板放置3塊病組織，用封口膜(PM996，Parafilm，BEMIS，USA)封閉培養皿。將培養皿倒置于25 ℃恒溫培養箱內(型號、廠家、國別)培養，定期觀察，待菌落長出后，在滅菌的超凈工作臺(型號、廠家、國別)內，使用滅菌的接種針挑取菌落邊緣，轉接至新的培養基平板上進行純化培養，培養條件同上，待長出單菌落后放入4 ℃冰箱保存，備用。

采用稀釋平板法進行病土中真菌的分離[14]。具體步驟：稱取土樣5 g放入盛有45 mL滅菌水的三角瓶中，搖晃20 min后靜置，上清液即為菌液，用1 mL滅菌移液管吸取1 mL菌液加入9 mL滅菌水中，用移液管吹洗3 次，搖勻即為稀釋10倍(10-1)的菌液，按照同樣方法依次梯度稀釋，直至視野(16×40倍)下可檢到1～2個孢子為止。用移液器分別取稀釋液 100 μL于 PDA培養基平板上，用滅菌玻璃棒涂布均勻，密封培養皿后置于25 ℃恒溫條件下培養，待菌落長出后，按上述方法純化菌落。將純化成功的菌落放入 4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 致病性測定 根據柯赫氏法則進行致病性檢測。分別從發病山藥塊莖和病土中純化的病原菌菌落打取菌餅(d=5 mm)，挑取健康的山藥塊莖，用流水清洗干凈后用體積分數75%的酒精涂抹接種部位，待酒精揮發后，采用針刺法刺傷待接種部位，將菌餅上長有菌絲的一面蓋在待接種部位。以接種無菌的PDA培養基塊作為對照。每種病原菌在一段山藥塊莖上設3個重復處理組和1個對照組，在25 ℃培養，定期觀察接種山藥塊莖的發病情況。將發病的山藥塊莖從病斑處再次分離培養病原菌，與原接種菌進行形態對比，形態學特征鑒定一致則確定為該病原菌。

1.2.3 病原菌的形態學鑒定 觀察病原菌菌落的形狀、顏色等特征，挑取菌絲制作病原菌鏡檢玻片，在光學顯微鏡(DP22,Olympus,日本)下觀察菌絲、分生孢子和分生孢子梗的形狀、顏色、大小等特征。查閱文獻對病原菌進行分類鑒定。

1.2.4 病原菌的分子生物學鑒定 DNA提?。杭兓蟮木浠鹃L滿平板時，刮取菌絲體放入研缽中，加入液氮快速研磨，按照2×T5 Direct PCR Kit(Plant)試劑盒(南京擎科生物科技有限公司，中國南京)操作步驟，采用加熱裂解法抽提DNA[15]，-20 ℃保存，備用。

PCR擴增：選用真菌通用引物ITSl(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTYATYGATATGC-3′)[16]對病原菌進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應 體 系 25 μL：12.5 μL 2 × T5 Super PCR Mix，上游、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL，8.5 μL ddH2O。取少量(4～5 μL)PCR擴增產物在8 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，檢測擴增成功，將PCR擴增產物送西安擎科生物科技有限公司進行測序。

系統發育樹的構建：將分離菌的ITS序列提交至NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行在線BLAST核酸序列比對，根據同源性初步確定待測菌的生物學種類。從NCBI數據庫下載相關的屬種序列和外類群序列，利用PAUP 4.0(http://paup.phylosolutions.com/)構建進化樹，比較確認致病菌的生物學種。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離、純化與回接再分離

田間發病的山藥塊莖，皮層完好，內部從皮層處侵染并向內部擴展，導致塊莖變褐色或黑褐色，呈濕腐狀，最終導致整個塊莖腐爛(圖1-A～D)。密閉環境條件下，病原菌從不定根處長出皮層，在皮層外呈現白色菌團(圖1-E)。

從發病山藥塊莖中分離得到3個病原菌分離株，從病土中分離得到3個病原菌分離株，將這6個分離株純化后的菌株接種于健康的山藥塊莖進行回接致病性測定，接種的塊莖在25 ℃恒溫培養箱內經過30 d的連續培養，回接致病性測定的結果表明，從發病山藥塊莖中分離純化的菌株只有1種具有致病力，可以引起山藥根腐病，記錄為Hu-1，發病部位變褐色、根腐、有水漬、表皮變皺(圖2-A)，其他2種菌株在健康山藥接種部位與對照組無差異，判定不是山藥根腐病的致病菌；從病土中分離純化的菌株中有2種具有致病力，可以引起山藥根腐病，分別記錄為Fu-2和Fu-3，發病癥狀與Hu-1的致病癥狀相似(圖2-B和圖2-C)，另外1種菌株在健康山藥接種部位與對照組無差異，判定不是山藥根腐病的致病菌。根據柯赫氏法則，對接種病斑再次分離培養，其菌落特征與原發菌株相同。因此，可以判定引起山藥根腐病的病原菌為2屬3種菌，分別為腐質霉屬Humicolasp.(Hu-1)、鐮孢屬Fusariumspp.(Fu-2、Fu-3)，回接分離菌后的相同時間內，菌株Fu-2引致山藥發病迅速且嚴重(圖2)。

2.2 病原菌的形態鑒定

病原菌菌株Hu-1在PDA培養基上生長菌落為圓形，從背面看呈多層環狀向外擴展，菌落中央顏色呈褐色，邊緣為灰白色，菌落生長致密，菌落表面呈絮狀(圖3-A～B)。菌絲具隔膜，分枝形成較短的分生孢子梗，分生孢子頂生于菌絲分枝形成的分生孢子梗上，呈圓形或近圓形，發育中的分生孢子顏色較淺，成熟后變為暗褐色(圖3-C～E)。

病原菌菌株Fu-2在PDA培養基上菌落背面呈鮮紅色，菌落邊緣顏色較淺、不整齊，菌落正面淺粉紅色，最上面的幼嫩菌絲最初呈白色，后變鮮紅色，菌落呈放射狀生長，似棉絮狀(圖4-A～B)。菌絲具隔膜(圖4-C)，分枝，大型分生孢子側生，鐮刀形，略彎曲，兩端漸變細，產生多個隔膜。(圖4-D～F)。

病原菌菌株Fu-3在PDA培養基上菌落呈粉白色，邊緣菌絲生長旺盛，不整齊，菌落正面突破絮狀，大量分生孢子產生呈粉質，菌絲白色，生長質密(圖5-A～B)。菌絲具隔膜，分枝產生分生子梗，頂生厚垣孢子，厚垣孢子近球形(圖5-C)。小型分生孢子頂生于分生孢子梗上，無色，單胞，腎形(圖5-D～E)。未觀察到大型分生孢子。

根據形態學特征和查閱相關文獻[17-19]，初步鑒定菌株Hu-1為棕黑腐質霉(Humicolafuscoatra)、菌株Fu-2為燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、菌株Fu-3為尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

利用真菌通用引物ITSl/ITS4對純化菌株rDNA-ITS進行PCR擴增、測序，菌株Hu-1、Fu-2、Fu-3的ITS區序列長度分別為537 bp、535 bp和516 bp。序列提交NCBI數據庫GenBanK，獲得基因序列登錄號分別為Hu-1(MW811547)、Fu-2(MW811520)、Fu-3(MW811523)。BALST序列比對結果表明，菌株Hu-1與棕黑腐質霉菌(Humicolafuscoatra,序列登錄號：MW453192)的序列匹配率(max score)最高，序列覆蓋度(qurey coverage)為98%，序列相似度(percentage identity)為99.06%。菌株Fu-2與燕麥鐮孢(序列登錄號：KY272764)的序列匹配率最高，序列覆蓋度為97%，序列相似度為99.23%。菌株Fu-3與尖孢鐮孢(序列登錄號：MT997878)的序列匹配率最高，序列覆蓋度為98%，序列相似度為99.60%。

這3個病原菌菌株與從NCBI下載的已知同屬以及外類群(outgroup)菌株序列(表1)，構建系統進化樹表明(圖6)，菌株Hu-1與棕黑腐質霉(Humicolafuscoatra,序列登錄號：MW453192)、棕黑腐質霉一未知種(Humicolasp.,序列登錄號：KJ528986)、棕黑腐質霉原變種(H.fuscoatra var.fuscoatra,序列登錄號：MH863738)聚在同一分支，親緣關系最近，而區別于腐質霉屬的其他種。序列比對結果表明，菌株Hu-1與棕黑腐質霉原變種(序列登錄號：MH863738)的序列一致性為71.29%(圖9-A)，與棕黑腐質霉(序列登錄號：MW453192)的序列一致性為97.59%(圖9-B)，與腐質霉未知種(序列登錄號：KJ528986)的序列一致性為89.7%(圖9-C)。結合形態學特征，確定菌株Hu-1為棕黑腐質霉HumicolafuscoatraTraaen。

菌株Fu-2與燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum，序列登錄號：KY272780)和三線鐮孢(F.tricinctum,序列登錄號：MW850537)聚在同一分支，親緣關系最近，而區別于鐮孢屬(Fusarium)其他種、毛殼菌屬(Chaetomium)、毛喙殼菌屬(Chaetomidium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、疫霉屬(Phytophthora)、馬杜拉孢殼屬(Madurella)、黃霉屬(Myceliophthora)、葡萄毛孢菌屬(Staphylotrichum)的種(圖7)。多序列比對結果表明，菌株Fu-2與燕麥鐮孢(F.avenaceum，序列登錄號：KY272780，KY272264)的序列一致性(identity)為96.15%，而與三線鐮孢(F.tricinctum，序列登錄號：MG704912，MW850537)的序列一致性為89.35%(圖8)。結合形態學特征，確定菌株Fu-2為Fusariumavenaceum。

菌株Fu-3與尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum，序列登錄號：MT997887，MT997878，MT997889)聚在同一分支，與尖孢鐮孢(序列登錄號：MT997887)親緣關系最近，與區別于鐮孢屬的其他種(圖7)，因此確定Fu-3為Fusariumoxysporum。

3 討 論

山藥根腐病是由土傳病原菌侵染導致的根腐、莖基腐和塊莖病害，病原菌通過菌絲體或菌核在土壤中或植株病殘體上越冬存活，可達2～3 a。該病害的病原菌可以通過多種途徑傳播，如罹病山藥(塊莖或幼苗)調運、雨水飛濺、土壤和帶菌肥料。本研究僅對陜西榆林一山藥種植戶所寄來的受害山藥樣品和根際土壤進行研究，明確引起山藥根腐病發生的病原菌，以進行相應地防治。因此，榆林地區的山藥根腐病的發生狀況有待于進一步調查研究。

本研究明確引起陜西榆林市榆陽區山藥根腐病的病原菌的種類有3種，即棕黑腐質霉(Humicolafuscoatra)、燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)，回接后相同時間內，燕麥鐮孢引致山藥發病迅速且最嚴重，但是，此3種致原菌均有可能上升為優勢種，根據本研究的結果來看，鐮孢屬種類是主要的致病種類，由于本研究所研究的樣本數量有限，尚不能確定該地區山藥根腐病的優勢種，有待于進一步研究。棕黑腐質霉是首次報道引起山藥根腐病的病原菌。按《現代菌物分類系統》(第10版)的分類系統[20]，棕黑腐質霉歸類于真菌界子囊菌門(Ascomycota)，盤菌亞門(Pezizomycotina)，糞殼菌綱(Sordariomycetes)，糞殼菌亞綱(Sordariomycetidae)，糞殼菌目(Sordariales)，毛殼菌科(Chaetomiaceae)，屬腐質霉屬(Humicola)，在自然中廣泛分布，為喜土菌，存在于中性或堿性土壤中。棕黑腐質霉可危害其他作物。Gruyter等[21]于1984年報道在荷蘭棕黑腐質霉危害無土栽培的番茄引起根腐，發現該菌存在番茄塊莖內。1993年，棕黑腐質霉造成加拿大溫室無土栽培的番茄根腐病暴發流行，造成約20%的產量損失，并從受害番茄根部分離獲得該菌[22]。Moghaddam等[23]從檉柳科、莧科植物組織內分離8株內生的棕黑腐質霉菌株。表明，棕黑腐質霉是一種植物內生真菌，條件適宜時，會侵染植物組織引起組織腐爛。

研究表明，山藥根腐病土壤中鐮孢屬往往占有較高的比例[24]。連作是導致作物根腐病發生的重要原因，根腐病的發生常常導致根際土壤微生物群落的變化，加劇病害的發生。研究表明，土壤微生物群落的變化是導致作物連作障礙產生的主要因素之一[25]。作物連作后，根際一些屬(如鐮孢屬Fusarium)的群體數量明顯呈上升趨勢，如尖孢鐮孢(F.oxysporum)、茄鐮孢(F.solani)、硫色鐮孢(F.sulphureum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)等致病菌的豐度明顯上升，從而造成根腐病等病害發生，影響作物(蔬菜、大田作物、中草藥、水量、花卉、煙草、苜蓿和林樹等)的產量與品質[26]，如馬鈴薯[27-28]、白術[29-30]、三七[31]、魔芋[32]、黃瓜[33]、地黃[34]、蘋果[35]。

山藥根腐病的發生與多種因素有關。山藥連作與根腐病的發生密切相關，連作地發病往往較重，連作年限時間愈長，發病愈重[36-37]。山藥根腐病的發生與溫、濕度也有很大的關系，高溫多雨或田間積水的條件下，山藥根腐病往往發生也較重，反之，干旱條件下，該病害亦較輕[38]。白天土壤溫度18 ℃～21 ℃，夜間土壤溫度15 ℃～16 ℃，有利于山藥根腐病的發生。在山藥種植地，根腐病于6月底至7月上旬開始發生，7月中、下旬至8月上旬進入發病盛期[7,9]。此外，種植過密、通風透光差；過量施用氮肥、土壤黏重、透氣性差、偏酸性；地勢低洼、排水不良、易積水等均有利于根腐病的發生[7]。

根腐病是山藥生產地區的重要病害，嚴重威脅該作物的生產與經濟效益。尖孢鐮孢山藥?；?FusariumoxysporumSchl.f.sp.discoreaeWellman)最初由Lopez于1971年在波多黎各島發現鑒定為尖孢鐮孢(F.oxysporum)，后來被Wellman于1986年進一步鑒定尖孢鐮孢山藥?；蚚38]。在中國，尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)危害山藥于1988年最早在湖北谷城縣菜用山藥上報道[36]，但是未鑒定致病菌否為山藥?；?。1994年，呂勁鋒等[10]在廣東首先分離并鑒定引起山藥爛根或死株的病原菌尖孢鐮孢山藥?；?。目前山藥根腐病在廣東[10]、四川雅安[8]、陜西漢中[39]、海南[40]、福建[41]、江蘇[42]、河南[37]等山藥種植區均有發生。因此山藥根腐病的預防以及防治尤為重要，本研究明確了榆林市榆陽區山藥根腐病的病原菌種類，為該地區山藥根腐病的防治奠定了基礎。

4 結 論

本研究明確了陜西榆林山藥根腐病是由腐質霉屬和鐮孢屬兩個屬的3種病原菌引起，棕黑腐質霉是首次報道危害山藥，鐮孢屬是引起該病害的主要病原菌種類。