低劑量糖蜜添加對吉富羅非魚養殖水質和微生物代謝多樣性的影響

楊 泳，王新池，尹統統，宋 超,，孟順龍，范立民

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081)

羅非魚是我國主要經濟魚類，據統計，我國2020年淡水養殖羅非魚產量約為166萬t。在池塘養殖羅非魚,養殖密度達17 400 kg/hm2時，每生產1 kg魚需消耗水21 000 L[1-2]，產量的大量增長常伴隨著養殖水環境的破壞。水產養殖發生水環境污染的原因主要是微生物、投喂飼料和水產品代謝產生的水體污染。在集約化水產養殖技術快速發展的當下，高密度養殖產生了大量代謝物及高蛋白飼料殘餌沉積，極易引起養殖水質惡化，影響養殖生物正常的攝食、生長，甚至導致疾病和死亡[3]。

糖蜜作為制糖工業的副產品，具有易獲取、成本低、用途廣的特點。在水產養殖中，糖蜜常用在肥水、防病、降低溶解氮、促進動物生長等方面[10]，以實現水產健康養殖，因此其非常符合作為補充碳源的要求[11]。本實驗利用Biolog-ECO法和檢測常規水質理化指標的變化，分析研究低劑量糖蜜添加對養殖水體水質及水體微生物代謝多樣性的影響，以期了解低劑量糖蜜添加對吉富羅非魚養殖水體水質的影響，為日后低劑量糖蜜在水產養殖中的應用提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

選用20個圓形聚乙烯養殖桶，容積為1 000 L。實驗前養殖桶經過消毒后，加入約800 L自來水，使用增氧泵曝氣7 d。曝氣后加入約1 L塘底淤泥，提供微生物源。之后開始為期90 d的羅非魚養殖，實驗期間養殖水體溫度控制在20～30 ℃，整個養殖周期不換水。養殖實驗期間需保證供氧充足，每個養殖桶均插入兩根輸氧管，連接曝氣石和增氧泵。實驗期間養殖水體溶解氧濃度維持在(7.0±1.3) mg/L。

選取同批次、同等規格的吉富羅非魚(GIFTOreochromisniloticus)，由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心屺亭基地提供，每個養殖桶放養20尾魚苗，平均體質量為(3.89±1.33) g，養殖過程中進行相同頻率的投喂，前期投喂量為體質量的1%，后期隨著魚體增長，調整為體質量的2%。按占投喂飼料質量的百分比設置4個不同的添加糖蜜梯度，分為對照組(C)、10%糖蜜實驗組(10S)、20%糖蜜實驗組(20S)和40%糖蜜實驗組(40S)，每組處理設5個重復。前期養殖時間為60 d，待魚體質量達到(10.00±0.13) g時(本實驗中為7月31日)，開始添加投喂糖蜜。添加過程為先用適量養殖水溶解糖蜜，然后進行全桶均勻潑灑，添加時間與投喂飼料時間相同(09:00和16:00)。糖蜜添加量根據日投喂飼料量調整。基礎飼料使用天邦食品股份有限公司產精養淡水魚1號配合飼料。

1.2 樣品采集與檢測

1.2.1 水質檢測

自7月31日起，每隔7 d從養殖桶水面以下30 cm處采集水樣，檢測水質指標包括pH、溶解氧(DO)、總氮(TN)、氨氮(NH3-N)、亞硝酸鹽(NO2-N)、硝酸鹽(NO3-N)、總磷(TP)和化學需氧量(CODMn)。采用鉬酸銨分光光度法測定TP濃度，過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定TN，納氏試劑分光光度法測定NH3-N，N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定NO3-N、NO2-N，高錳酸鉀-草酸鈉滴定法測CODMn質量濃度。pH及DO采用玻璃電極法測定[12]。

1.2.2 水體微生物代謝多樣性檢測

9月10日，用250 mL采樣瓶取養殖桶水面下30 cm處養殖水體，沉淀2 h。沉淀完成后取上清液，用8孔加樣器吸取150 μL加至Biolog-ECO微平板中，設置光照培養箱28 ℃恒溫避光培養，每12 h使用Beckman Beachmark plus酶標儀(新振儀器設備有限公司，上海)讀板一次，共讀取14次Blank590和Blank750波長的數值，選擇96 h的數據來分析不同樣品中微生物對不同碳源利用效率的顯著性差異，并進行微生物多樣性指數及微生物群落主成分分析。

1.3 數據分析

讀取Blank590和Blank750波長數值后，計算各實驗組和對照組平均每孔顏色變化率(AWCD)，分析96 h時的數據，探究微生物對6大類碳源利用效率的顯著性差異，進行主成分分析(PCA)并計算各樣點的Shannon指數、McIntosh指數、Simpson優勢度指數和豐富度指數。運用Microsoft office軟件進行數據處理，用Graphpad Prism 9.0軟件進行繪圖。

AWCD、Shannon指數、McIntosh指數、Simpson優勢度指數和豐富度指數計算公式如下：

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

AWCD代表微生物群落利用碳源的整體能力。其中Ci為微平板31個碳源孔的吸光度值；R為對照孔的吸光度值；n為碳源的總數，在Biolog-ECO板中，n=31。

Shannon指數：H′=∑PilnPi

(2)

H′反映物種豐富度信息。Pi表示第i個孔的吸光度值與所有非對照孔吸光度值的比值(下同)。

Simpson指數：D=1-∑Pi

(3)

D表示優勢度指數，衡量樣本中優勢種群信息。

(4)

U反映微生物群落均一性的變量。ni表示第i孔的相對吸光度值。

豐富度指數為被利用碳源的總數，即Ci-R的值大于0.25的孔個數。

2 結果與分析

2.1 低劑量糖蜜添加對吉富羅非魚養殖水質的影響

7月31日首次投喂糖蜜后的兩次采樣中，實驗組NH3-N濃度均高于對照組(圖1-A)。8月24日后，實驗組NH3-N濃度逐漸低于C組且40S組NH3-N濃度顯著低于C組。此外，自9月7日采樣起，各組NH3-N濃度隨糖蜜投喂量增加而減少，特別是40S組與C組間有顯著差異。

養殖過程中水體里TN、TP的含量同樣呈現先上升后下降的趨勢，整體看變化幅度不大。8月24日后(圖1-B)，各實驗組濃度開始低于對照組，但無顯著差異。CODMn在養殖水體中的變化則是呈現先上升后穩定的趨勢，并且糖蜜添加組含量始終高于C組。

圖1 低劑量糖蜜添加對吉富羅非魚養殖水質的影響

2.2 低劑量糖蜜添加對吉富羅非魚養殖水體微生物代謝多樣性影響

AWCD主要作用是通過一段時間內微平板孔內顏色的變化來反映微生物利用碳源的能力。由圖2可知，不同濃度糖蜜投喂下養殖水體中的微生物對碳源整體的利用效率均隨著培養時間的增加而增加。0～24 h區間內，微生物利用碳源程度較低，AWCD值上升緩慢，C組的微生物活性略高于糖蜜添加組的微生物活性。24～96 h區間內，各組微生物AWCD值快速上升，微生物利用碳源效率達到高峰。對不同組ECO微平板96 h AWCD值進行單因素方差分析發現，C組與各糖蜜添加組中的微生物AWCD值均無顯著性差異。總體趨勢上看，低劑量糖蜜添加組的微生物AWCD值變化幅度稍大于C組，不同組之間微生物AWCD大小排序為20S組>10S組>40S組>C組。表明低劑量糖蜜添加組中微生物對不同碳源的利用能力稍強一些。

圖2 吉富羅非魚養殖水體微生物對碳源利用情況

2.3 不同低劑量糖蜜添加下養殖水體微生物對不同碳源的利用效率

圖3是在低劑量糖蜜投喂量的情況下，微生物對不同種類碳源的利用率情況。總體上，不同糖蜜投喂濃度下養殖水體微生物對6類不同碳源的利用效率隨著時間的推移呈現上升趨勢。對聚合糖類碳源的利用，在96 h后表現為緩慢下降的狀態；對氨基酸類碳源，20S組與40S組108 h后明顯高于C組及10S組；對酯類碳源的利用則是40S組明顯高于低濃度糖蜜添加組及C組；對醇類碳源的利用效率整體最低，并且差異極小；對胺類及酸類碳源的利用強度則是10S組明顯高于C、20S和40S組。整體上看，不同糖蜜添加組之間對醇類碳源利用效率最低，對氨基酸類、酯類碳源利用效率較高。10S組對胺類碳源的利用強度顯著高于C組和其他糖蜜實驗組。對其他各類碳源的利用，各組之間無顯著性差異。

圖3 不同濃度糖蜜下吉富羅非魚養殖水體微生物對碳源利用

2.4 不同低劑量糖蜜添加下吉富羅非魚養殖水體微生物多樣性指數

微生物多樣性指數包括Shannon指數、Simpson優勢度指數、McIntosh指數和豐富度指數等組成。表1顯示除10S和40S組的McIntosh指數較對照組顯著升高以外，其他各實驗組各指數均與對照組差異不顯著。

表1 不同濃度糖蜜下吉富羅非魚養殖水體微生物多樣性指數

2.5 不同微生物群落對不同碳源的利用情況

為研究不同糖蜜投喂濃度下吉富羅非魚養殖水體微生物群落碳代謝的影響，選取Biolog-ECO微平板培養96 h作為分析時間點進行主成分分析(PCA)，提取3個主成份，第一主成分(PC1)為48.74%，第二主成分(PC2)為23.93%，第三主成分(PC3)為12.17%，三個主成分綜合了全部碳源84.84%的信息，提取前2個主成分作主成分分析圖。其中兩個主成分貢獻率達72.67%。由圖4-3可知C組主要分布在第I、IV象限，10S組主要分布在第I、II象限，20S組主要分布在第II象限，40S組主要分布在III、IV象限。10S組與20S組的三個點均在第II象限，說明兩組之間相似度高。C組與各實驗組之間距離較遠，說明相似度不高，具有一定差異性。反映出低劑量糖蜜添加條件下養殖水體微生物群落有不同的群落結構，具有不同的碳代謝特點。

圖4 不同微生物群落主成分分析

3 討論

3.1 低劑量糖蜜添加對吉富羅非魚養殖水質的影響

本研究結果顯示，養殖過程中實驗組與對照組一樣水體里TN、TP的含量呈現先上升后下降的趨勢，整體看變化幅度不大。但糖蜜投喂28 d后，各實驗組濃度開始低于對照組，但實驗組間無顯著差異，顯示出糖蜜對去除水體中TN、TP雖有一定的效果，但并不顯著,這與湯佩武[19]利用生物絮團調控水質的研究結果相一致。本實驗發現，對TN的去除率，隨糖蜜投喂量的增加而增加。對TP的去除率則是20S組最好并且與對照組差異顯著(P<0.05)，其他組間并未產生明顯差異。TP的去除大部分是依靠水體中浮游植物消耗，隨著糖蜜添加量的增加，養殖水體中浮游動植物數量也相應增加，最終TP濃度得到一定降低[20]。40S組并未與對照組產生明顯差異的原因可能與投喂糖蜜后產生的大量異養菌對養殖水體中游離態磷的利用率不高有關[21]。

CODMn在養殖水體中的變化則是呈現先上升后穩定的趨勢，并且糖蜜添加組含量始終高于對照組。CODMn含量的大小與水中有機和無機可氧化物質數量息息相關。各實驗組CODMn含量均高于對照組的原因可能是投喂糖蜜后，糖蜜本身作為有機物添加后必然帶來CODMn的升高。并且隨著C/N升高，大量異養菌繁殖，與水體中殘餌、原生動物等產生大量生物絮團，從而造成耗氧量的增加。但是過高的CODMn可能表明養殖水體中生物排泄物、殘餌與浮游動植物殘骸等顆粒懸浮物過多，養殖者需及時吸污排出以保證良好的養殖水環境[22]。

如今，越來越多的學者開始嘗試用微生態制劑與糖蜜配合使用改善養殖水質。如張曉陽等[23]在凡納濱對蝦養殖中將芽孢桿菌與糖蜜配合使用，與僅使用糖蜜相比，產量提高了19.13%，餌料系數降低了22%。廖藝樞[24]通過實驗研究了乳酸菌與糖蜜配合投喂對吉富羅非魚生長性能的影響，發現其存活率、增重率顯著高于對照組。未來，將糖蜜與其他微生態制劑配合使用處理養殖廢水可能會成為一個發展方向。

3.2 低劑量糖蜜添加對吉富羅非魚養殖水體微生物代謝多樣性的影響

Blolog-ECO微平板法通過平均每孔顏色變化率數值的高低反映微生物群落利用31種碳源的整體偏好[25]。通過不同組數值之間的差異，可以深入分析各組間微生物群落的變化趨勢，并且可以計算不同環境影響下微生物的多樣性指數[26]。楊鶯鶯等[27]利用Biolog-ECO技術對池塘水環境的微生物群落進行分析，結果池塘水環境中微生物對氨基酸類、酸類和糖類碳源利用率較高。董媛媛等[28]通過在羅非魚養殖中利用生物絮團進行餌料替代實驗，發現養殖水體微生物對脂類和胺類碳源利用率較高，對酸類利用率最低。兩人實驗結果有很大不同，可能是因為實驗環境的不同影響了微生物對碳源的利用。

在本次實驗中，各實驗組AWCD值平穩后數值均高于C組(圖2)，表明實驗組微生物群落對碳源利用水平高于C組。張哲等[29]通過實驗發現，微生物群落結構隨著添加碳源的變化也會發生一定的變化。根源在于不同的微生物對不同的碳源利用效率不同。因此加入不同的碳源會對微生物群落結構造成一定影響。本實驗以糖蜜作為添加碳源，且實驗全程溫度適宜、pH穩定、溶解氧充足，微生物能夠有良好的生長繁殖環境，最終各組數值產生一定差異，這與于皓等[30]的研究結果相吻合。進一步對本實驗中微生物對六大類碳源的利用能力分析發現，最主要的利用碳源類型為氨基酸類和酯類，其次是酸類和聚合糖類，最后是醇類和胺類(圖3)，這與楊鶯鶯等[27]的實驗結論相吻合。

通過對各組進行微生物多樣性指數分析，發現各實驗組與對照組之間Shannon指數、Simpson指數和豐富度指數之間均無明顯差異，而McIntosh指數，實驗組顯著高于對照組，說明實驗組微生物多樣性與對照組有明顯差異。通過對各組養殖水體培養96 h時微生物碳源代謝進行主成分分析(PCA)發現各組散點圖分布區域有一定差異，相關研究表明，不同條件下微生物群落有不一樣的結構特點，因此產生了不同的碳源代謝特征[31]。這與本實驗在不同濃度糖蜜投喂后散點圖分布比較分散相吻合。 雖然單憑Biolog-ECO微平板技術很難完整地反映生態環境微生物多樣性的變化規律，但通過運用BIolog-ECO技術對低劑量糖蜜投喂濃度條件下養殖水體的微生物群落進行分析，對運用低劑量糖蜜進行水產健康養殖仍具有一定借鑒意義[32]。

4 結論

本實驗研究結果表明，低劑量糖蜜添加可有效降低吉富羅非魚養殖水體水質中無機氮的濃度，并且隨著糖蜜投喂量的增加，無機氮濃度降低趨勢更加明顯。糖蜜添加對TN和TP的去除也有一定效果。同時，投喂低劑量糖蜜明顯增強了微生物對碳源的利用能力，微生物代謝能力增強，實驗組微生物活性明顯高于對照組。綜合考慮成本等因素后，推薦20%糖蜜添加為適合的使用劑量。