基于主成分分析和隸屬函數的谷子全生育期耐旱性鑒定

肖繼兵，劉 志，辛宗緒，李俊志，陳國秋，朱曉東，孫占祥

(1.遼寧省旱地農林研究所，遼寧 朝陽 122000；2.遼寧省農業科學院，遼寧 沈陽 110161)

干旱是限制全球生產的最重要的非生物因素之一[1]，其危害相當于其他自然災害的總和[2-3]，嚴重影響植物正常生長發育，制約作物產量[4]。我國旱地面積占全國總土地面積的52.5%，每年因干旱損失的糧食達1億t以上[5-6]。為了應對干旱威脅，對作物的耐旱性進行遺傳改良是當務之急，而鑒定和評價作物種質資源的耐旱性是耐旱育種的前提條件[7]。我國谷子種植面積約100萬hm2，占世界總面積的80%，在旱作農業生產和滿足食物多元化消費中占有重要地位[8-9]。谷子是禾本科作物耐旱研究的新型模式作物[10-13],雖然耐旱性較強，但干旱仍然是影響其產量和品質的主要因素之一[14]。因此，谷子耐旱育種過程中，有必要對供試種質資源進行耐旱性鑒定。

多年來，國內外學者針對作物不同品種的耐旱性提出了多種鑒定方法[15-22]，并從形態[23-25]和生理生化[26-28]等方面的鑒定指標進行了研究。目前，對谷子耐旱性鑒定的研究主要是在谷子的萌芽期、苗期和全生育期，通過模擬不同程度水分脅迫，依據形態指標、生理生化指標和產量指標等，通過多元統計分析的方法對種質資源耐旱性進行綜合評價和指標篩選[29-33]，苗期耐旱性鑒定是目前谷子種質資源耐旱性鑒定采用的主要方法[31-33]。張文英等[34]和劉婧等[35]研究認為根冠比、單穗粒重、灌漿期光合速率、蒸騰速率、株高、穗長可作為谷子全生育期耐旱性鑒定的指標，并用株高和穗長的耐旱系數和產量耐旱指數對谷子品種耐旱性進行了評價，認為谷子全生育期耐旱性鑒定結果相對更為可靠[35]。近年來相關耐旱基因和蛋白的研究能更確切地分析鑒定谷子的耐旱性[36-38]。谷子耐旱性評價和指標篩選過程中，為了避免單一指標的片面性和不穩定性，研究者們采用了主成分分析、隸屬函數分析、聚類分析和逐步回歸分析等相結合的方法進行多指標綜合評價，而指標性狀的耐旱系數和耐旱指數在評價體系中應用較為廣泛[34-35,39-41]。然而任何評價方法都是對作物耐旱性實際結果的估計，不能代表其真正的耐旱能力。迄今為止，國內外對耐旱性鑒定指標和評價方法均沒有準確可靠的統一規定，對作物耐旱性評價方法的研究仍未取得突破性進展。目前普遍認為，多指標多方法相結合的耐旱性綜合評價相對更加真實可靠[42]，可以較好地揭示指標性狀與耐旱性的關系。本文通過考量谷子相關農藝性狀和產量指標的耐旱系數，建立谷子全生育期耐旱性評價的可靠方法和鑒定指標，以期為谷子耐旱種質資源鑒定及耐旱新品種選育提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗于2019—2020年在遼寧省旱地農林研究所示范基地進行(118°50′～121°20′E，40°35′～42°20′N)，屬北溫帶大陸性季風氣候，四季分明，晝夜溫差大，年平均氣溫7.15℃，年平均日照時數2 800 h，10℃以上積溫平均為3 220℃，無霜期150 d左右，年平均降水量438.9 mm，季節分布不均，70%～74%的降水集中在6—8月份，以雨養農業為主，一年一熟。供試土壤為砂壤質褐土，含有機質11.05 g·kg-1、全氮0.77 g·kg-1、堿解氮54.0 mg·kg-1、有效磷12.15 mg·kg-1、速效鉀128.0 mg·kg-1、pH為7.6，田間持水量為19.5%。2019年和2020年谷子生育期降水量分別為341 mm和382 mm。

1.2 試驗設計

試驗設干旱脅迫(DS)和對照(CK)2種處理，每種處理30份谷子材料。采用隨機不完全區組設計(alpha-格子設計)，各處理設3次重復，小區面積1.5 m2(1.5 m×1 m)，每個品種播種3行，行長1.5 m，行距25 cm，株距6.8 cm。播種前每區施高氮長效緩釋復合肥(含N 26%、P2O512%、K2O 12%)600 kg·hm-2作為基肥，整個生育期不再追肥。干旱處理在移動式耐旱棚的干旱池內進行，播種前和定苗(5～6葉期)后分別灌水至田間持水量的70%，之后不再灌水，進行干旱脅迫處理；對照處理(非水分脅迫)在移動式耐旱棚外鄰近地塊進行，生長期間以自然降水為主，若遇嚴重干旱，適當灌水，保證谷子正常生長。供試谷子材料見表1。

試驗期間不同處理土壤質量含水量(烘干法測定)見圖1。2019年和2020年谷子抽穗期和成熟期，CK和DS處理各層次土壤水分t測驗差異均達顯著水平。2019年，DS處理抽穗期和成熟期0～20 cm土層土壤相對含水量分別為33.79%和31.69%，0～60 cm土層土壤相對含水量分別為48.21%和44.51%；2020年，DS處理抽穗期和成熟期0～20 cm土層土壤相對含水量分別為37.23%和29.02%，0～60 cm土層土壤相對含水量分別為41.64%和37.13%。一般認為當土壤相對含水量<40%時，作物受旱嚴重，土壤相對含水量為40%～60%時，作物呈現旱象[43]。2個處理土壤水分差異主要在抽穗期至成熟期，DS處理0～20 cm土層土壤含水量達重旱程度，說明谷子干旱脅迫處理有效。

表1 供試谷子材料Table 1 The tested foxtail millet materials

注：*和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著。Note:* and ** indicates the significant difference at P<0.05 and P<0.01,respectively.圖1 不同處理土壤水分Fig.1 Soil water of different treatments

1.3 測定項目與方法

農藝性狀調查包括株高(PH)、倒二葉葉面積(LA)、主莖節數(SNN)、穗頸長(TNL)、莖葉干重(SLDW)、穗長(SL)、單株穗重(SWP)、穗粒數(KPS)、千粒重(TGW)、單株粒重(GWP)和小區產量(Y)，成熟后每小區中間行取樣10株，參照谷子種質資源描述規范和數據標準進行，取2 a平均值作為供試性狀測定值。

1.4 數據處理

耐旱系數采用式(1)計算[29]:

(1)

式中,DC為指標性狀的耐旱系數；xi、CKi分別表示干旱、對照處理的性狀測定值，n為指標性狀數量；i為指標性狀。

通過主成分分析計算各基因型谷子耐旱綜合指標值。

F(Xj)=a1jX1j+a2jX2j+…+a1jXij
(i=1,2,…,n;j=1,2,…,n)

(2)

式中,F(Xj)為第j個綜合指標值，aij表示各單一指標的特征值所對應的特征向量，Xij為各單一指標標準化處理值。

采用式(3)～(4)計算隸屬函數值和耐旱性度量值[22,44]:

(3)

(4)

式中,u(xj)為各品種第j個綜合指標的隸屬函數值，xj表示第j個綜合指標，xjmin和xjmax表示第j個綜合指標的最小值和最大值；Pj為第j個綜合指標貢獻率，表示第j個綜合指標在所有指標中的重要程度；D為耐旱性度量值。

采用SPSS 26.0進行配對樣本t測驗、主成分分析和相關分析，采用DPS 18.10進行聯合方差分析和灰色關聯度分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對谷子農藝性狀和產量的影響

聯合方差分析表明(表2)，土壤水分環境和基因型對農藝性狀均有顯著影響，而且土壤水分環境與基因型互作對谷子生長性狀有顯著影響，說明生長性狀更易受環境變化的影響。干旱脅迫下，各指標性狀值較CK均發生不同程度下降。t測驗結果表明(表3)，處理間各性狀成對數據差異均達到極顯著水平(TGW除外)，其中SWP差異最大，其次為TNL。干旱脅迫處理和CK處理各性狀變異系數分別為8.53%～43.32%(均值24.42%)和6.95%～48.36%(均值21.15%)，干旱脅迫處理各性狀變異系數均大于對照(Y除外)。SNN和TGW的變異系數小于10%，說明二者在谷子材料間的離散程度較小。

2.2 各指標性狀耐旱系數

從表4(見 39頁)可以看出，供試谷子材料在干旱脅迫處理后，各性狀平均耐旱系數均小于1。各指標性狀耐旱系數平均值從大到小依次為TGW、SNN、SL、LA、PH、TNL、SLDW、SWP、KPS、GWP、Y。同一材料不同性狀及不同材料同一性狀耐旱系數均有較大差異，說明各指標性狀對干旱脅迫反應的敏感性不同。由此可見，用任何單一指標的耐旱系數來評價品種的耐旱性都存在片面性和不穩定性，必須用多個指標進行綜合評價才較為可靠。

表2 干旱脅迫和供水條件下不同基因型谷子農藝性狀的聯合方差分析Table 2 Combined analysis of variance for agronomic traits of different foxtail millet genotypes under drought stress and well-watered

表3 供試谷子材料形態和產量指標描述性分析Table 3 Descriptive analysis of morphology and yield indicators of foxtail millet

2.3 谷子種質資源耐旱性綜合評價

前文已經分析，所選農藝性狀指標對干旱脅迫反應的敏感性存在顯著差異，說明各指標對谷子耐旱性評價的重要程度不同，需要用多指標進行綜合分析。主成分分析方法能夠通過線性變換從多元隨機變量中提取相互獨立的少數幾個重要變量，重新組合成一組新的、互相無關的綜合指標，并客觀確定每個綜合指標的權重。利用SPSS軟件對30份谷子材料的11個鑒定指標的耐旱系數進行主成分分析。如果谷子耐旱評價指標之間沒有相關性，則不能運用主成分分析法篩選出反映谷子耐旱能力的主要因子，因此本研究對所測定的各項農藝性狀進行相關分析。由圖2可見(見 40頁)，各農藝性狀指標間存在一定的相關性，有些指標相關系數達顯著或極顯著水平，其中株高、穗長、倒二葉葉面積和莖葉干重之間的耐旱系數極顯著正相關，穗重、穗粒數、穗粒重和產量之間的耐旱系數極顯著正相關，適合使用主成分分析。

表4 供試谷子材料各性狀耐旱系數Table 4 Drought tolerance coefficient of each trait of foxtail millet genotypes

特征值在某種程度可看成是表示主成分影響力大小的指標，一般可用特征值>1及方差累計貢獻率>80%作為主成分個數的提取原則。由表5可以看出，主成分分析將原來的11個評價指標轉化為3個相互獨立的綜合指標，方差累計貢獻率為81.269%。第一主成分相當于5.866個原始指標的作用，可以解釋53.327%的方差，其中PH、LA、SLDW、SL、SWP、GWP指標載荷系數絕對值較大，說明這些指標可以較好地反映谷子的耐旱性，其中以SWP指標載荷絕對值最大；第二主成分主要反映的是TNL和KPS指標，相當于1.961個原始指標的作用，其中以TNL載荷絕對值最大；第三主成分中起主要作用的是SNN、TGW、Y指標，相當于1.113個原始指標的作用，其中以TGW載荷絕對值最大。3個主成分的因子權重分別為0.656、0.219、0.124。

利用各指標的耐旱系數(表4)和各主成分的特征向量(表5)，通過公式(2)可以分別求出每個谷子材料的3個綜合指標值。在干旱脅迫下，同一綜合指標數值越大，說明谷子耐旱性越強，反之越差。但谷子的耐旱性由這3個綜合指標值共同決定，而且這3個綜合指標在谷子耐旱性評價中的重要性不同。因此，利用公式(3)和(4)在綜合指標基礎上利用隸屬函數計算各材料綜合耐旱指標D值(表6，見41頁)，其值越大，耐旱性越強。用D值作為標準來判別各參試材料耐旱能力的強弱，并對其進行排序。可以看出，G26的D值最高，耐旱能力最強，其次為G15和G30，G6的D值最低，耐旱能力最弱。

圖2 谷子農藝性狀耐旱系數相關分析Fig.2 Correlation analysis on drought tolerance coefficient of agronomic traits in foxtail millet

表5 供試谷子材料各指標主成分的特征向量及貢獻率Table 5 Characteristic vectors of each index and contribution rate of principal components of foxtail millet

基于供試谷子材料D值，采用歐氏距離和非加權組平均法(UPGMA)對30份谷子材料耐旱性進行聚類分析(圖3)。結果表明，參試30份谷子材料耐旱性可劃分為5類，G1、G4、G14、G15、G17、G25、G26、G29、G30為Ⅰ類，屬極強耐旱類型；G2、G3、G5、G9、G10、G13、G16、G21、G22、G23為Ⅱ類，屬強耐旱類型；G7、G19、G24、G28為Ⅲ類，屬中度耐旱類型；G8、G12、G18、G20、G27為Ⅳ類，屬干旱敏感型；G6和G11為Ⅴ類，屬干旱高度敏感型。

2.4 谷子種質資源耐旱指標篩選

由表7可以看出，各指標DC值與D值Pearson 相關分析和灰色關聯度分析均表明，PH與D值關系最緊密，其次為SWP，TGW與D值相關聯程度最小，同時各指標DC值與D值相關系數均達極顯著水平(P<0.01)，TGW除外。

表6 供試谷子材料耐旱性綜合評價Table 6 Comprehensive evaluation on drought tolerance of foxtail millet

圖3 參試谷子材料D值的非加權組平均法聚類分析Fig.3 UPGMA clustering analysis of D value of foxtail millet

表7 供試谷子材料各指標DC值與D值相關分析和灰色關聯度分析Table 7 Analysis of correlation and grey relation between DC and D values of each index of foxtail millet

為了確定供試谷子材料耐旱性鑒定首選指標，依據耐旱性聚類分析結果(圖3)進行Fisher判別分析。結果表明，株高(PH)和單株穗重(SWP)對供試谷子材料耐旱性歸類有顯著影響(P<0.01)，判別函數如下：

YΙ=500.845PH+222.838SWP-286.540

YⅡ=456.282PH+185.898SWP-227.942

YⅢ=460.557PH+172.858SWP-224.291

YⅣ=398.277PH+163.884SWP-174.846

YⅤ=341.061PH+138.566SWP-127.905

3 討 論

3.1 谷子耐旱性鑒定方法

干旱脅迫是影響谷子生長發育的重要因素，對谷子進行耐旱性鑒定就是選用合適的評價方法和鑒定指標對不同基因型耐旱能力大小進行篩選、評價和歸類的過程。植物生理學意義上的耐旱性是指植物對干旱脅迫的適應性和抵抗力，其耐旱能力的高低主要表現在產量方面。產量的高低是農業生產中作物耐旱性能最實用的表現[45]，因而有學者提出了以產量指標為依據的耐旱性直接評價方法[18-19,21,46-47]。這種評價方法能夠簡便、快速地對耐旱性進行大致的評判，但可能不利于從整體上把握作物耐旱的類型和機理，難以全面準確反映各材料的耐旱性強弱，而且也有研究認為僅依靠產量指標難以真正鑒定出作物的耐旱性[48]。作物的耐旱性是受多基因控制的復雜的數量性狀，很難用單個指標進行鑒定，使用多指標評價更能從不同階段、不同側面反映作物耐旱性的強弱和特點，相應的產生多種評價方法。多指標結合多方法的綜合評價結果更為合理可靠，可避免單一性狀的片面性和不穩定性[19-20,40,49]。隸屬函數法將作物的不同性狀表現值，放在統一尺度下進行綜合比較，使其具有可比性，可以反映多個構成成分的整體水平及綜合特征，能夠消除不同基因型谷子間固有的生物學和遺傳學特性差異。

同一作物不同品種原有背景并不相同，因此，綜合考慮作物在正常供水和干旱處理條件下的性狀表現是鑒定作物耐旱性強弱的最有效方法。耐旱系數法是經典的耐旱性評價方法，為世界各國學者所認可，反映了干旱脅迫條件下作物農藝性狀和產量的變幅，也就是對干旱脅迫的敏感程度，可有效消除不同谷子材料的遺傳背景差異，是目前作物耐旱性鑒定用得最多的方法[50]。用耐旱系數法篩選的材料不一定具有較好的豐產性，但其可能蘊藏著耐旱基因，可為耐旱育種提供優異資源[47]，是一種簡捷的度量基因型與環境互作的指標[34]。本文通過各指標性狀耐旱系數主成分分析，較好地揭示了谷子耐旱相關性狀與其耐旱性的關系，并確定耐旱性評價的各綜合指標及相應的因子權重。通過選用反映谷子不同方面耐旱性的3個相互獨立的綜合指標并結合隸屬函數求得谷子各材料耐旱性度量值D，以此作為谷子材料耐旱性強弱的判定標準，可以消除單純依靠個別指標造成的結果片面性。林漢明等[51]認為，當多項指標綜合評價獲得的結果(如D值)符合連續變數的理論分布即正態分布時，可將結果劃分為5級。本文D值為連續變數且符合正態分布，因此，依據D值通過聚類分析將供試谷子材料耐旱性分為5類，每類代表不同的耐旱級別。

3.2 谷子耐旱評價指標的篩選

聯合方差分析表明，土壤水分環境對耐旱指標有顯著影響，說明所選農藝性狀指標可用于谷子耐旱性評價。基因型對各指標影響顯著，表明所選谷子基因型豐富，適宜進行耐旱性鑒定。基因型與環境交互作用揭示了基因型在不同環境中相對表現的不穩定性，顯示了基因型的尺度效應。本研究表明，基因型與土壤水環境的交互作用顯著影響谷子的生長性狀，但對產量性狀的影響不顯著(TGW除外)，即不同的土壤水分環境下，生長性狀的穩定性低于產量性狀，產量性狀可能具有相對較強的耐旱性。

作物的耐旱性是環境脅迫與基因型互作的結果，最終通過各種性狀在不同發育時期的一系列變化體現出來，不同指標性狀對干旱脅迫的敏感性存在很大差異，因而指標性狀的合理選擇是耐旱性鑒定的關鍵。谷子耐旱性是在水分脅迫環境下，植物體內細胞在形態結構、生理生化上發生一系列適應性改變后，在植株形態和產量上的集中表現，是一個復雜的綜合性狀。一般來說，生長發育和產量指標是鑒定耐旱性的可靠指標。已有研究表明，谷子成株期以產量性狀對干旱脅迫最為敏感，株高、單株穗重、單穗粒重和穗長等指標可作為谷子全生育期耐旱鑒定指標[34-35,40,52]。植株生長過程中對干旱所做出的反應表現為農藝性狀的改變，本文以不同處理下測定的農藝性狀和產量指標表現值為依據進行研究。結果表明，各耐旱評價指標平均耐旱系數均小于1，但有些材料個別指標的耐旱系數大于1(如G7的SNN，G9的SLDW，G15的TGW等)，說明干旱脅迫促進了這些指標性狀的增加，這可能是由于不同種質材料抵抗干旱脅迫的能力不同所致。通過主成分分析可以看出，PH、SWP和GWP指標在第一主成分中載荷系數絕對值較大，與谷子耐旱性密切相關。通過判別分析確定PH和SWP可作為遼西地區谷子全生育期耐旱性鑒定首選指標，這與前人研究結果基本一致。干旱脅迫下的植株高度是該種群的主要特征，干旱脅迫最明顯的影響之一就是植株高度降低[53-54]。這是由于干旱脅迫導致植株體內水分匱乏，必然影響到生理生化過程和器官建成，進而對生長發育造成傷害。植物生長迅速時(營養生長階段)的水分脅迫首先限制了植物的株高[55]，降低了凈光合速率，使植物的同化產物減少[56]，同時降低了結實率，進而減少穗粒數和單株穗重，不同程度影響谷子的形態建成和產量構成。株高是判斷作物在干旱條件下能否正常生長的直觀形態指標，可以作為耐旱性評價的可靠有力證據[55]，產量性狀(如穗重等)是作物是否耐旱的最終表現。本研究提出的11個指標均為農藝性狀指標，下一步需將形態、生理生化指標和耐旱功能基因及干旱誘導蛋白等鑒定指標綜合考慮進行谷子全生育期耐旱性評價，進一步篩選經濟、可靠的鑒定指標。

4 結 論

土壤水分環境和基因型顯著影響谷子農藝性狀，基因型和土壤水分環境互作顯著影響谷子生長性狀，對產量性狀影響不顯著(千粒重除外)。基于多指標多方法的谷子全生育期耐旱性評價結果與生產實際表現相符。株高和穗重可作為谷子全生育期快速、準確的耐旱性鑒定指標。