干旱和鹽脅迫對向日葵葉片蠟質積累的影響及蠟質烷烴合成基因的克隆

隗正陽，安沛沛，吳洪啟，劉 樂，肖恩時，景 兵，王中華

(西北農林科技大學農學院，陜西 楊凌 712100)

植物表皮蠟質覆蓋在植物表皮細胞最外層，是由超長鏈脂肪酸及其衍生的醇、烷烴、醛、酮等組成的疏水性混合物，其主要功能是限制植物非氣孔水分流失，進而提高植物抗旱性[1-3]。同時表皮蠟質還可使植物免受紫外線傷害及減少植物表面空氣污染物的沉積，在植物育性、植物-病原菌互作方面也具有重要作用[4-7]。

植物葉表皮蠟質的積累是植物體內重要的生理過程，受環境脅迫的影響較為嚴重[8]。通常情況下，干旱和鹽脅迫能夠導致葉片蠟質顯著增加。Kosma等[5]研究發現，干旱和鹽脅迫8d后擬南芥葉片蠟質總含量分別增加了80%和75%；所有蠟質組分中，烷烴含量增加最明顯，可分別增加98%和93%。這種變化與角質層滲透性降低有關，并且可能有助于植物在水分缺失條件下生長。同樣，干旱脅迫后胡楊、鹽生水芹和番茄等植物葉片蠟質明顯增加，而這種變化也是由烷烴組分含量增加導致[9-11]。以上研究表明，蠟質組分中烷烴在植物響應干旱和鹽脅迫中起著重要作用。然而，烷烴作為植物表皮蠟質的重要組成成分，其合成的具體機制仍不清楚[12-13]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和玉米(Zeamays)相應突變體中的研究證明了CER1和CER3及其同源基因在烷烴合成中的重要作用，擬南芥中改變CER1(At1G02205)和CER3(At5G57800)的表達都直接影響其烷烴含量[7]。在豌豆(Pisumsativum)和藍藻(Cyanobacteria)的研究中證明烷烴的合成需要兩個步驟：首先脂酰輔酶A還原酶將脂酰輔酶A轉化為中間體醛，然后醛脫羰基酶催化中間體醛脫羰基生成烷烴[14-15]。基于藍藻中烷烴合成的步驟及擬南芥突變體表型的研究，CER1蛋白被認為是一種催化醛脫羰基酶，而CER3蛋白被認為是一種可以將脂酰輔酶A還原為醛的酶[6,7]。Bernard等[16]利用改造的酵母證明了CER1和CER3蛋白能夠相互作用形成二聚體酶復合物，并在輔助因子CYTB5的促進作用下將脂酰輔酶A轉化為烷烴。

向日葵(HeliauthusannuusL.)是我國干旱、半干旱地區的重要油料作物，干旱、鹽脅迫能夠導致向日葵產量和種子含油量大幅下降，是限制向日葵生產的主要因素[17]。目前關于向日葵表皮蠟質與干旱和鹽脅迫的研究鮮有報道，因此探究脅迫條件下向日葵表皮蠟質的變化，挖掘表皮蠟質相關合成基因的工作尤為必要。本研究擬分析向日葵葉片表皮蠟質的組成及其在干旱和鹽脅迫下的變化，在向日葵基因組中檢索到6個烷烴合成候選基因，分析候選基因的組織表達譜，并在向日葵葉片中克隆其中的兩個候選基因HaCER1-1和HaCER3-1，利用qRT-PCR分析HaCER3-1基因在脅迫下的表達量變化，研究成果可望為后續研究向日葵中烷烴合成機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為油用向日葵(HeliauthusannuusL.)高代自交系‘SKY02R-32’。供試材料種植于10 cm× 10 cm的塑料花盆內，在培養箱(GDN型，寧波)內培養，光周期為16 h/8 h，溫度為22℃/21℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 干旱、鹽脅迫下向日葵葉片表皮蠟質提取 對三周齡的向日葵進行缺水、200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)、15% 聚乙二醇6000(PEG6000)和H2O(對照組)處理，除缺水處理外各溶液均取100 mL澆灌根系，處理一周后剪取所有葉片提取表皮蠟質，每個處理設3個生物學重復，利用ImageJ軟件計算葉面積，用氯仿浸提表皮蠟質同時加入20 μg C24烷烴作為內參，浸提液過濾至燒杯內，揮發至0.5～1.0 mL時轉移到GC瓶內，利用氮吹儀吹干，然后加入40 μL吡啶和40 μL BSTFA[N,O-雙(三甲基硅烷基三氟乙酰胺)]混勻并置于70℃水浴鍋內反應60 min，反應結束用氮氣吹干GC瓶內液體，最后加入800 μL氯仿用于氣相色譜—質譜聯用儀(GC-MS，GCMS-QP2010S，日本島津)分析。

1.2.2 GC-MS分析 利用氣相色譜—質譜聯用儀檢測浸提的蠟質混合物獲得各成分的離子峰，通過檢索質譜數據庫對各離子峰進行定性，利用Lab Solution軟件對各離子峰進行積分，獲得峰面積，根據C24內標的加入量對所有成分進行定量分析。計算公式如下：

M=(20·S峰)/(S葉·S內標)

(1)

式中，M表示表皮蠟質某一成分絕對含量(ng·cm-2)，S峰表示該成分離子峰面積(cm2)，S葉表示該樣品葉片表面積(cm2)，S內標表示C24烷烴的離子峰面積(cm2)。

1.2.3 烷烴合成候選基因生物信息學分析 利用擬南芥烷烴合成基因AtCER1(AT1G02205)和AtCER3(AT5G57800)序列在向日葵數據庫(https://www.heliagene.org/)中檢索相應同源基因，利用在線工具Pfam(http://pfam.xfam.org)分析蛋白結構域并利用TBtools作圖，運用MEGA6軟件的鄰位相連法構建系統進化樹。

1.2.4 烷烴合成候選基因表達模式分析 在向日葵轉錄組數據庫(https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/plants/FATAL/cgi/HELAN.cgi)中下載烷烴合成候選基因的表達譜數據，利用TBtools軟件對數據進行可視化。

1.2.5HaCER1-1和HaCER3-1的克隆 利用Primer Premier 5進行引物設計(表1)，以‘SKY02R-32’葉片cDNA為模板，進行PCR擴增，將擴增產物純化回收后備用。利用XbaⅠ酶將pCAMBIA2300載體線性化，用無縫克隆試劑盒(DT101-01，DiNing，北京)將目的片段與載體連接后轉化大腸桿菌感受態DH5α，進行抗性篩選，挑選單克隆，PCR鑒定后送往上海生工生物股份有限公司測序。測序正確的菌液擴大培養后用質粒小提試劑盒(StarPrep，GenStar，北京)提取質粒“pCAMBIA2300-HaCER1”和“pCAMBIA2300-HaCER3”。

1.2.6 NaCl和PEG處理下HaCER3-1的表達分析 分別用200 mmol·L-1NaCl(溶劑為H2O)、15% PEG6000和H2O(對照組)100 mL澆灌四葉期向日葵幼苗，處理3、6、12、24 h時剪取葉片，每個處理取3個生物學重復，利用RNA提取試劑盒(貝貝生物科技有限公司)提取RNA，反轉錄合成cDNA(Vazyme，南京)用于qRT-PCR分析，使用QuantStudio3(美國)進行qRT-PCR分析，每個反應設置3個技術重復，反應體系及反應程序按照北京康潤誠業生物科技有限公司的實時熒光定量試劑盒(A311，康潤誠業，北京)說明書確定。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 干旱、鹽脅迫下向日葵葉片表皮蠟質分析

為了研究干旱及鹽脅迫對向日葵幼苗表皮蠟質的影響，提取了脅迫處理后向日葵的葉表皮蠟質進行了GC-MS分析。圖1顯示，正常狀態下三周齡向日葵幼苗葉片表皮蠟質主要成分為初級醇、烷烴和脂肪酸等，初級醇含量達到0.988 μg·cm-2，約占葉片蠟質總量的70%～80%，烷烴含量為0.12 μg·cm-2，占10%～14%，脂肪酸含量為0.114 μg·cm-2，占9%～13%。初級醇共鑒定到6種，烷烴鑒定到11種，脂肪酸鑒定到6種。碳鏈長度分析結果顯示，初級醇的碳鏈長為22-34；烷烴碳鏈長為25-35，C27和C29烷烴含量最高；脂肪酸碳鏈長為16-28。缺水、氯化鈉和PEG的處理均能提高向日葵葉片表皮蠟質總量，且缺水和氯化鈉處理下表皮蠟質總量升高最為顯著，分別提高了8.8%和8.5%，其中升高的主要是烷烴和脂肪酸的含量，缺水和鹽脅迫處理下，烷烴單位葉面積升高量分別為62.5%和47%，脂肪酸升高量為45%和49%(表2)。

2.2 烷烴合成候選基因生物信息學分析

利用擬南芥烷烴合成基因AtCER1(AT1G02205)和AtCER3(AT5G57800)序列在向日葵基因組中進行同源比對，共獲的3個AtCER1同源基因和3個AtCER3同源基因，將其命名為HaCER1-1(HanXRQr2_Chr16g0763931)、HaCER1-2(HanXRQr2_Chr15g0714831)、HaCER1-3(HanXRQr2_Chr13g0570411)、HaCER3-1(HanXRQr2_Chr02g0049271)、HaCER3-2(HanXRQr2_Chr06g0262671)和HaCER3-3(HanXRQr2_Chr05g0202951)。氨基酸序列分析發現這6個序列與其他物種中的同源序列都含有兩個完整的保守結構域-脂肪酸脫氫酶超家族(FA_hydroxylase)和Wax2_C(圖2)，說明這兩個結構域對于烷烴的合成至關重要。系統進化樹分析表明3個HaCER1蛋白能夠與其他物種CER1同源蛋白聚為一類；3個HaCER3蛋白同樣與其他CER3同源蛋白聚為一類；HaCER3-1與擬南芥AtCER3的進化關系最近；同時向日葵的這6個蛋白與雙子葉植物親緣關系更近(圖2)。

表2 不同處理下向日葵葉片表皮蠟質各組分的含量Table 2 The content of the cuticular wax compositions in sunflower leaves/(μg·cm-2)

注：柱形圖下方各數字表示該化合物所含碳原子數Note：Number below in each column is the carbon atom number of thecorresponding chemical compound圖1 干旱、鹽脅迫下向日葵葉片表皮蠟質主要組分Fig.1 Main components of sunflower leaf cuticular wax under drought and salt stress

2.3 烷烴合成候選基因表達模式分析

通過轉錄組數據庫獲得各基因在不同組織中表達的RPKM值，結果顯示6個基因在根中的表達都很低，在莖中只有HaCER3-1和HaCER3-2表達，在葉片中HaCER1-1和HaCER3-1兩基因的表達量最高，可能參與了葉片中烷烴的合成。而在向日葵花冠中HaCER1-2、HaCER1-3、HaCER3-2和HaCER3-3均有較高的表達量(圖3)。

2.4 HaCER1-1和HaCER3-1的克隆

對候選基因HaCER1-1和HaCER3-1進行PCR擴增后，其目的片段與預期大小一致，約1 700 bp。經測序兩個基因的CDS序列分別為1 869 bp和1 674 bp(圖4)，分別包含一個完整開放閱讀框，編碼氨基酸個數分別為622和557。

2.5 NaCl和PEG處理下HaCER3-1的表達分析

qRT-PCR結果表明，HaCER3-1的表達受到NaCl和PEG誘導，在12 h內隨著處理時間的增加，基因的表達量均呈逐漸上升的趨勢，在第12 h時表達量達到最大值，200 mmol·L-1NaCl溶液的處理可以使HaCER3-1增加10倍以上，15% PEG6000溶液的處理可以使其增加3倍以上；在第24 h時基因的表達量下降，但仍高于0 h(圖5)。由此推測HaCER3-1在響應干旱及鹽脅迫過程中起重要作用。

3 討論與結論

不同植物的表皮蠟質組分及比例均有不同，擬南芥葉片表皮蠟質主要由烷烴、醇類和脂肪酸組成，小麥葉片表皮蠟質中主要為初級醇、烷烴和二酮，番茄葉片表皮蠟質主要由烷烴、初級醇和三萜類組成，糜子的表皮蠟質主要是初級醇和烷烴，約占蠟質總量的95%[18-21]。本研究通過GC-MS技術分析了油葵自交系‘SKY02R-32’葉片的表皮蠟質組分，發現向日葵幼苗表皮蠟質主要成分為初級醇、烷烴和脂肪酸等。

注：除向日葵外，其他物種蛋白ID如下AtCER1(NP_001184890.1);AtCER1-like1(NP_171721.3);AtCER3(NP_200588.2);BnCER1(XP_013722199.1);ZmGL1(ONM55119.1);OsGL1-1(XP_015651446.1);OsGL1-2(XP_015623214.1);OsGL1-3(XP_015641638.1);OsGL1-4(XP_015627618.1);OsGL1-5(Q7XDI3.1);OsGL1-6(XP_015624738.1);OsGL1-7 (CAE03390.2);CsCER1(XP_004153200.1);CsCER3(XP_004149879.1)圖2 系統進化樹和蛋白保守結構域圖Fig.2 The phylogenetic tree and protein conserved domain analysis

圖3 基因組織表達譜Fig.3 Gene expression profiles in different tissues

圖5 脅迫下HaCER3-1的表達量變化Fig.5 HaCER3-1 expression at different time under different abiotic stresses

圖4 HaCER1-1和HaCER3-1的序列Fig.4 Sequences of HaCER1-1 and HaCER3-1

在許多植物中干旱脅迫能夠誘導植物單位葉面積表皮蠟質含量的提升，包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatobacum)等[5,22-26]。本試驗對向日葵干旱及鹽脅迫后的葉片表皮蠟質進行分析，發現干旱脅迫和鹽脅迫均能提高向日葵葉片單位面積蠟質總量。雖然較多研究表明植物表皮蠟質與其抗旱性密切相關，但是表皮蠟質組分、結構與植物抗旱性的關系仍然缺乏深入研究[27]。Leide等[28]發現角質層透水性與角質層的厚度無關，而是與其特定組分如烷烴有關。Parsons等[29]在辣椒(Capsicumannuum)采后失水率有關的研究中同樣發現，辣椒采后失水率的高低與蠟質總量無關，而與烷烴比例呈負相關。Kim等[30]對18個芝麻品種進行缺水處理，之后分析了這些品種的葉片表皮蠟質變化，結果顯示這些品種的葉蠟中平均59%為烷烴，干旱脅迫后葉蠟總量增加34%，其中主要是烷烴的增加。本研究發現干旱和鹽脅迫后向日葵葉片表皮蠟質總量有明顯提升，其中烷烴含量的提高最為明顯，推測烷烴對向日葵響應干旱、鹽脅迫，提高保水能力具有重要意義。

Eceriferum(CER)家族是脅迫條件下調控表皮蠟質合成的主要基因家族之一，目前CER基因在擬南芥、小麥、玉米、番茄(Lycopersiconesculentum)、黃瓜(Cucumissativus)等植物中都有報道[6,31-34]。CER1和CER3蛋白被認為是烷烴合成途徑的關鍵酶[7,16,35]。二者在表達模式、結構域方面有許多相似之處，如兩種蛋白的N端都有一個富含組氨酸的結構域-脂肪酸脫氫酶超家族，C端都有一個WAX2結構域[9]，本研究在向日葵數據庫內共檢索到3個CER1同源蛋白和3個CER3同源蛋白，6個蛋白序列均有完整的保守結構域，并且系統進化樹表明6個蛋白與已知的CER1和CER3同源蛋白進化關系較近。通過轉錄組數據分析6個基因的表達譜，發現在根、莖和葉組織中表達的有HaCER1-1、HaCER3-1和HaCER3-2，推測這三個基因在向日葵葉片合成烷烴的過程中起作用。本研究克隆了其中兩個烷烴合成候選基因，命名為HaCER1-1和HaCER3-1，其CDS長分別為1 869、1 674 bp。利用qRT-PCR分析了NaCl和PEG處理下HaCER3-1的表達量變化，發現HaCER3-1的表達有明顯的上調。因此推測HaCER3-1可能參與向日葵葉片中烷烴合成，在向日葵響應干旱和鹽等脅迫，適應缺水環境的過程中具有重要作用。

干旱和鹽脅迫是限制植物生產力的主要因素之一，轉基因育種和分子設計育種是培育抗旱耐鹽品種最經濟有效的途徑之一，因此發現和挖掘向日葵抗逆基因至關重要。本研究分析了向日葵幼苗葉片表皮蠟質組成及干旱、鹽脅迫下其表皮蠟質的變化，并克隆了兩個烷烴合成候選基因HaCER1-1和HaCER3-1，利用qRT-PCR技術分析了脅迫下HaCER3-1的表達量變化，為后續深入研究向日葵烷烴合成的機制奠定基礎。