長期有機/無機肥配施對褐土細菌群落及抗生素抗性基因賦存的影響

劉志平，解文艷，楊振興，胡雪純，馬曉楠，周懷平

(山西農業大學資源環境學院，省部共建有機旱作農業國家重點實驗室(籌)，山西 太原 030001)

有機肥與無機肥配合施用是目前農業生產中所推崇的一種施肥方法，既可以改良培肥土壤又可以提高作物產量，這是因為有機肥可將大量的有益微生物帶入土壤。作為土壤的重要組成部分，微生物是土壤有機質和養分循環的主要驅動力，在土壤養分轉化、能量流動和土壤有機質形成中具有關鍵作用[1-4]。細菌常因對土壤環境變化反應迅速而被作為土壤質量的早期生物指標[5-6]。細菌多樣性和群落組成受土壤pH、有機質、土壤水分、礦物質等因素影響[7-8]，而這些因素又受施肥管理措施的影響。因此，研究細菌群落及多樣性對于指導合理施肥具有重大意義。

隨著畜禽養殖的集約化，作為亞治療劑量的食品添加劑，抗生素被廣泛應用于畜禽養殖業以防治動物疾病、促進動物生長及提高飼料利用率。我國是世界上最大的抗生素生產國和消費國之一，統計表明，2013年中國的抗生素生產量為2.48×105t，使用量達1.62×105t，居世界第一，約占世界總量的一半，其中約7.8×104t為人類使用，占比48%，其余8.4×104t用于畜禽養殖[9]。大約30%～90%獸用抗生素通過糞便或尿液以母體化合物或代謝產物的形式排出[10-12]。未經充分腐熟的畜禽糞污還田又將抗生素帶入土壤，雖然抗生素可以通過生物降解和光解等作用進行轉化，但低濃度抗生素殘留也會對微生物群落產生選擇性壓力，誘導產生抗生素抗性基因(Antibiotic Resistence Genes，ARGs)，一些ARGs甚至能夠在選擇性壓力消失后持續存在，使得土壤成為豐富的ARGs儲存庫[13-15]。土壤中賦存的ARGs可以通過食物鏈的傳遞對人體健康造成潛在危害。與其他污染物相比，ARGs分布范圍更廣、傳播速度更快、環境風險更高，是人類面臨的最嚴峻的生態環境問題[16]，已被世界衛生組織列為21世紀威脅公共健康的最重大挑戰之一[17]。隨著檢測技術的發展，越來越多的ARGs在污水處理廠、動物糞便、土壤、河流、飲用水、冰川等不同環境樣品中被檢測出來[18-22]。

研究土壤細菌及ARGs的方法眾多，其中宏基因組技術作為一種新興技術可直接從樣品中提取總DNA構建宏基因組文庫進行測序，進而獲得樣品中所包含的全部微生物及其遺傳基因信息[23]，有助于全面了解不同環境中細菌群落及ARGs的多樣性與豐度變化。在耕地中，檢測長期施用有機肥對土壤中ARGs賦存特征的影響具有重大意義，可以從食物鏈源頭評估施用有機肥對生態安全及食品安全的潛在風險，但目前此類研究尚較為缺乏。本研究以山西壽陽長達30年的有機/無機肥配施試驗為基礎，基于宏基因組測序技術分析耕層土壤ARGs及細菌多樣性，旨在研究不同有機/無機肥配施對褐土中細菌群落及ARGs賦存特征的影響，為今后農業生產中有機肥的投入量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究中長期定位試驗位于山西省晉中市壽陽縣宗艾鎮宗艾村國家農業環境壽陽觀測實驗站(37°58′23″N，113°06′38″E)，海拔1 130 m，土壤類型為褐土，系統分類為簡育干潤雛形土[24]。該區域屬中緯度暖溫帶半濕潤偏旱區大陸性季風氣候區，年均氣溫7.4℃，年均降水量500 mm。試驗地初始pH為8.4，有機質23.8 g·kg-1；堿解氮117.69 mg·kg-1；有效磷4.84 mg·kg-1；有效鉀100 mg·kg-1[25]。

該長期定位試驗從1992年開始種植春玉米直至2021年，歷時30 a。試驗采用氮(N)、磷(P)、有機肥(M)三因素四水平正交設計，另設有對照和高量有機肥區，共18個處理，各處理3次重復，小區面積66.7 m2，隨機排列。玉米品種為‘大豐30’，播種密度為66 000株·hm-2，玉米播種前進行旋地和施肥，方式為全部播前基施。本研究依據腐熟牛糞用量梯度，選擇其中5個處理，即N0P0M0，N2P1M1，N4P2M2，N3P2M3和N0P0M6，研究長期施用牛糞對土壤ARGs及細菌多樣性的影響，具體施肥量見表1。

表1 不同試驗處理施肥量Table 1 Amount of fertilizer applied in different experimental treatments

1.2 樣品采集

于2021年6月在各小區采用5點“S”取樣法，用土鉆采集0～20 cm的土壤樣品，將同一小區的5個樣混合為一個樣品，去掉明顯的石礫和殘枝敗葉等雜物后將土壤分成兩部分，一部分風干用于土壤理化性質的檢測，另一部分用無菌袋裝好，并置于冰盒帶回實驗室，進行土壤DNA的提取及后續宏基因組測序。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤理化性質測定 土壤理化性質的測定方法按照《土壤農業化學分析方法》[26]進行。其中，pH采用酸度計檢測，水土比為2.5∶1；堿解氮(AN)采用比色法檢測；有效鉀(AK)采用1 mol·L-1乙酸銨火焰光度計檢測；有效磷(AP)采用NaHCO3(pH 8.5、0.05 mol·L-1)浸提法測定；有機質(OM)采用重鉻酸鉀容量法檢測；全氮(TN)采用凱氏定氮儀檢測；全磷(TP)采用鉬銻抗比色法檢測；全鉀(TK)采用火焰光度法檢測。

1.3.2 土壤宏基因組測序 準確稱取0.5 g土樣，采用Fast DNA SPIN DNA提取試劑盒(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,United States)，按照說明書的方法提取土壤DNA，并用0.7%的瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察條帶是否清晰、完整，而后用微量紫外分光光度計NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA) 測定DNA的濃度。將合格DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行宏基因組測序。

1.4 數據統計

對測序原始數據通過FastQC進行質量評估，并通過Trimmomatic進行過濾處理[27]，得到有效數據。使用IDBA_UD對各樣本有效序列進行拼接組裝成長序列contigs，并對多個Kmer的組裝結果進行綜合評定，選擇最佳Kmer組裝結果。采用Prodigal對拼接結果進行ORF預測，選擇長度≥100 bp的基因并將其翻譯成氨基酸序列，對于各樣本的基因預測結果，采用CD-HIT軟件進行去冗余，以獲得非冗余的基因集[28]。使用DIAMOND將基因集與ARDB(Antibotic Resistance Genes Database)數據庫進行比對，獲得基因的物種注釋信息和功能注釋信息，并根據基因集豐度得到功能豐度和物種豐度[29]。利用QIIME計算Chao1、ACE、Simpson和Shannon指數。利用MEGAN[30]進行細菌群落分類組成和豐度可視化。采用R軟件繪制不同處理ARGs維恩圖，采用主成分分析(Principal component analysis，PCA)法研究不同樣品間ARGs的變化。采用置換多元方差分析(PERMANOVA)[31]評估各組間ARGs組成差異的顯著性，通過CANOCO軟件進行門水平細菌與ARGs的冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。

采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，檢驗土壤理化性質、細菌α-多樣性指數等的正態分布和方差同質性。采用LSD檢驗分析數據間的顯著性差異(P<0.05)，并進行細菌門及ARGs與土壤理化性質間的皮爾森相關性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質分析

不同有機/無機肥配施對土壤理化性質的影響如表2所示，與對照處理N0P0M0相比，施肥顯著降低了土壤pH值，且隨總施肥量增加呈現顯著降低趨勢。與此相反，隨施入養分量的增加，土壤OM、TN、TP、AN和AP的含量均呈增加趨勢(P<0.05)。

2.2 土壤細菌多樣性分析

2.2.1 細菌α-多樣性α多樣性指數反映了細菌物種的豐富度及均勻度，是鑒定土壤肥力的有效指標之一。由表3可見，不同有機/無機肥配施處理下，細菌Chao1指數在N2P1M1處理和N0P0M6處理中顯著高于N4P2M2處理(P<0.05)，ACE指數在N2P1M1處理中顯著高于N4P2M2處理(P<0.05)，Simpson指數和Shannon指數在4個處理中無顯著差異。

表2 各處理土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties in each treatment

表3 不同處理細菌α多樣性Table 3 Bacterial α-diversity under different treatments

2.2.2 土壤門水平細菌豐度 由圖1可見(見 172頁)，不同處理土壤樣品中門水平細菌種類相似，相對豐度前五位的分別為變形菌門(Proteobacteria，48.6%～59.1%)、酸桿菌門(Acidobacteria，7.19%～16.4%)、放線菌門(Actinobacteria，8.61%～15.1%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，5.19%～6.97%)和綠彎菌門(Chloroflexi，2.53%～4.21%)，平均相對含量占總量的82.6%～85.9%。變形菌門、放線菌門和綠彎菌門的相對豐度隨著養分投入量的增加呈先升高后降低的趨勢，N3P2M3處理變形菌門相對豐度最高且顯著高于其他處理(P<0.05)；N4P2M2處理放線菌門和綠彎菌門相對豐度最高，且顯著高于其他處理(P<0.05)。酸桿菌門的相對豐度隨牛糞施用量的增加呈下降趨勢，且N0P0M0處理顯著高于N2P1M1處理，但在N4P2M2、N3P2M3和N0P0M6處理中無顯著差異。芽單胞菌門的相對豐度隨牛糞施用量增加呈升高趨勢，且N0P0M6處理顯著高于N0P0M0處理。

圖1 不同處理門水平細菌相對豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria at phylum level under different treatments

2.3 土壤抗生素抗性基因分析

2.3.1 抗生素抗性基因Venn圖 由圖2可見(見 172頁)，5個處理土壤樣品共有256個共同ARGs亞型，N0P0M0、N2P1M1、N4P2M2、N3P2M3和N0P0M6處理含有的獨特ARGs亞型個數分別為0，0，1，5和3，說明高量施用牛糞可增加土壤獨特ARGs亞型的數量，且隨著養分投入量的增加呈先增加后降低趨勢，并在N3P2M3處理達到峰值。

圖2 不同處理抗生素抗性基因Venn圖Fig.2 Venn diagram of antibiotic resistance for different treatments

2.3.2 抗生素抗性基因組成 15個土壤樣品中檢測到的ARGs亞型共有318個，共分為12個種類。其中亞型較多的種類有大環內酯-林可霉素-鏈陽性霉素B類(48個)、氨基糖苷類(39個)、四環素類(34個)、萬古霉素類(34個)、多藥類(31個)。圖3展示了相對豐度前30位的ARGs亞型，平均相對豐度>3%的抗性基因亞型有13種，按照含量高低依次為MacB、BcrA、MexW、MexF、pbp1a、CarA、VanSD、CeoB、VanRE、VanRC、VanRA、tetPB和otrA，其中萬古霉素類抗性基因居多，MacB基因和BcrA基因在N3P2M3處理中含量最高、在N0P0M0處理中含量最低。

圖3 ARGs相對豐度Fig.3 Relative abundance of ARGs

2.3.3 主成分分析及置換多元方差分析 將注釋到的ARGs進行降維處理，提取主成分進行分析。由圖4可知，三個主成分共解釋了62.71%(PC1：31.97%，PC2：15.86%，PC3：14.88%)的ARGs組成及變化。每個處理的三個重復聚攏在一起，說明樣品平行性良好。置換多元方差分析進一步顯示(圖5)，不同施肥處理中土壤ARGs差異顯著，檢驗結果可信度高(R=0.9926，P=0.001)。

圖4 ARGs主成分分析Fig.4 Principal component analysis of ARGs

圖5 置換多元方差分析Fig.5 Permanova

2.3.4 抗生素抗性基因與門水平細菌的冗余分析 為了評價ARGs與細菌群落結構之間的關系，選擇相對豐度前十位的ARGs和門水平細菌進行冗余分析。由圖6(見 172頁)可知，細菌群落可以解釋89.8%(RDA1：80.7%，RDA2：9.1%)的ARGs變化。變形菌門與MacB、CarA、BcrA、VanRC、VanRA等之間的夾角均為銳角，表明它們之間呈正相關關系；酸桿菌門(Acidobacteria)與tetPB、MexF、pbp1a等呈正相關關系，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與MexW、CarA、MacB、BcrA等呈正相關關系，表明這些細菌門中的某些物種可能是相應ARGs的重要宿主菌。綜上所述，ARGs的變化受細菌群落結構的影響。

2.3.5 門水平細菌及ARGs與土壤理化性質的相關性分析 為了進一步揭示細菌及ARGs與土壤理化性質間的關系，對排名前十位的細菌門和ARGs與8項土壤理化性質進行皮爾森相關性分析。如表4所示，除了放線菌門(Actinobacteria)、MexF和CeoB以外，其余細菌門及ARGs與某些理化性質均存在顯著相關性。變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、MacB、BcrA、MexW、CarA、VanRA和VanRC除了與土壤pH呈負相關外，與其余因子均呈正相關關系；與此相反，酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、Bacteria_noname、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、MexF和tetPB除了與土壤pH呈正相關外，與其余因子均呈負相關關系。土壤OM、TN和AN與門水平細菌和ARGs的相關性呈現相似的規律；TP和AP與門水平細菌和ARGs的相關性呈現相同的規律。綜上所述，土壤理化性質直接或間接地影響著細菌群落和ARGs的組成和變異。

3 討 論

3.1 不同有機/無機肥配施對土壤細菌多樣性的影響

不同有機/無機肥配施影響了細菌的α-多樣性，細菌Chao1指數和ACE指數在N2P1M1處理中高于其他處理，分析認為該施肥量下土壤環境(碳源、水分、pH)為細菌生長和繁殖提供了良好的條件，更有利于保持細菌多樣性。土壤養分的可利用性通常與貧營養微生物向富營養微生物的轉化有關。例如，土壤中較高的養分利用率促進了富營養微生物的生長和繁殖，而在營養有限的土壤環境中，生長緩慢的貧營養微生物的數量會增加[32-33]。變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門是本研究土壤樣品中豐度最高的五大菌門，占細菌總數的82%以上，與之前不同系統報道的結果一致[34-36]。在這些菌門中，變形菌門被認為是一種廣泛存在于土壤中的富營養微生物，在糞便處理中其豐度相對較高；酸桿菌門內的大多數類群被認為是生長緩慢的貧營養細菌[32]。本研究中，N3P2M3和N0P0M6處理中變形菌門的相對豐度顯著高于N0P0M0處理(P<0.05)；與之相反，隨著養分投入量增加，酸桿菌門豐度呈現下降趨勢，貧營養微生物綠彎菌門的相對豐度在N0P0M6處理中降到最低。

圖6 抗生素抗性基因與門水平細菌的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of ARGs and bacteria at phylum level

3.2 不同有機/無機肥配施對土壤抗生素抗性基因的影響

隨著養殖業的集約化及獸用抗生素的廣泛使用，畜禽糞便已經成為殘留抗生素的主要儲存庫，其施用到耕地土壤后，會明顯激發土壤微生物的抗性及ARGs的豐度[37]。本研究中，PCA和Permanova表明，不同有機/無機肥配施處理ARGs存在顯著差異(P<0.001)，分析認為施肥通過改變土壤養分影響了土壤中細菌的活性，進而導致ARGs出現差異。

含量較多的ARGs有大環內酯類、多藥類、萬古霉素類、四環素類、氯霉素類，這些ARGs普遍存在于畜禽糞便、草魚腸道、土壤及水體中[38-41]，相對應的這幾類抗生素也是廣譜性抗生素。其中萬古霉素是一種臨床上重要的糖肽類抗生素，對革蘭氏陽性菌和一些多重耐藥菌具有極好的殺滅效果，被稱為人類健康的最后一道防線[42-43],但在本長期定位試驗中，萬古霉素類的抗性基因亞型最多，這不得不引起我們的警惕。

本研究中未施用牛糞的處理N0P0M0中仍然有大量的ARGs，這進一步說明ARGs的存在具有普遍性[37]。分析其原因認為土壤微生物本底中含有ARGs，也有可能是長年累月施肥中，ARGs通過水平轉移到達空白土壤[44]。ARGs中的質粒、轉座子、整合子等可移動因子可以通過接合、轉化和轉導等方式從一種菌株轉移到其他菌種中，從而使后者攜帶相應的抗性，并通過微生物的大量繁殖將ARGs傳遞下去。因此當微生物菌群一旦建立對抗生素的抗性，即便抗生素的選擇壓力消失，這類菌群也會持續對此類抗生素產生抵抗作用[45]。

4 結 論

(1)不同有機/無機肥配施處理改變了細菌及ARGs的多樣性，且不同處理間ARGs差異顯著(P<0.001)。

表4 優勢細菌門及抗生素抗性基因與土壤理化性質的皮爾森相關性分析Table 4 Pearson correlation analysis of dominant phylum-bacteria and ARGs with soil physicochemical properties

(2)不同有機/無機肥配施處理褐土中，5個主要的細菌門依次為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門。

(3)不同有機/無機肥配施處理褐土中，相對豐度較高的ARGs種類為大環內酯類、多藥類、萬古霉素類、四環素類、氯霉素類；其中相對豐度最高的ARGs為MacB、BcrA和MexW。

(4)土壤理化性質直接或間接地影響著細菌群落及ARGs的組成和變異，而ARGs的變化受細菌群落結構的影響。

ARGs已經成為威脅人類健康的潛在污染物，農業生產中施用畜禽糞污時應充分腐熟并與化肥配合施用，以保障生態環境安全。在未來研究中，探索有機肥與化肥的合理配比既可以保障糧食安全，又可以合理規避ARGs帶來的潛在風險。