參竹心康湯抗心衰大鼠心肌纖維化的實驗研究*

成笑楠 喻正科 趙文博 李玉瑩

（1.湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006）

參竹心康湯是湖南省中醫藥研究院附屬醫院喻正科教授的經驗方，具有益氣養陰，活血化瘀之功效，治療心力衰竭療效確切［1］。嚴重心力衰竭患者1年生存率小于50%［2］。前期研究表明［3-5］，參竹心康湯能改善HF大鼠心肌重構，具有明顯抗心肌纖維化作用，該方抗心肌纖維化作用與調控TGFβ1/CTGF通路有關［6］。本實驗觀察參竹心康湯對微小核糖核酸-21（miRNA-21）/磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）以及內皮間質轉化（EndMT）的影響，探討參竹心康湯改善心力衰竭心肌纖維化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠55只，SPF清潔級，體質量（200±30）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，適應性喂養7 d。本實驗由湖南省中醫藥研究院中藥研究所動物倫理委員會批準，倫理號為2020-0052。

1.2 實驗藥物

參竹心康湯（組成：黨參、麥冬、黃芪、三七、澤蘭、五味子、玉竹、丹參、黃精、葶藶子、姜黃），藥材購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科，煎藥機煎藥，濃縮至含生藥4.5 g/mL，冷卻后置于4℃冰箱備用。卡托普利片（華中藥業股份有限公司生產，國藥準字H42020384，批號20190203，規格25 mg×100片），藥片研磨成粉，加入蒸餾水混勻，制成質量濃度為3.25 mg/mL的混懸液，置于4℃冰箱備用。

1.3 試劑與儀器

Masson染色試劑盒（維爾生物科技有限公司，批號20201215）；miRNA逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀，CW2141）；CD31抗體，α-SMA抗體（英國Abcam，批號分別為ab28364、ab7817）；CoraLite488標記的山羊兔抗IgG（H+L），CoraLite594標記的山羊鼠抗IgG（H+L），PTEN抗體，GAPDH抗體、HRP標記山羊抗鼠二抗、HRP標記山羊抗兔二抗（美國Proteintech，批號分別為SA00013-2、SA00013-3、22034-1-AP、10494-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2）。光學顯微鏡（Motic，BA410T）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，H1650R）；熒光定量RCP儀，熒光PCR板（美國Thermo，型號分別為PIKOREAL96、SPL0960）。

1.4 模型制備

隨機數字表法隨機選取45只大鼠復制CHF模型，采用腹主動脈縮窄法［4］造模，剩余10只大鼠為假手術組。假手術組僅用無菌4號手術線穿過腹主動脈下方，不結扎腹主動脈，其余操作步驟與造模組相同。造模后8周，從兩組中隨機各抽取3只大鼠，采用二維超聲引導M型曲線測量射血分數（EF）、左室短軸縮短率（FS）、左室舒張末期內徑（LVIDd）、左室收縮末期內徑（LVIDs）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）。與假手術組比，造模組LVIDd有所增加（P＜0.05），LVIDs、LVESV均顯著增加（P＜0.01），EF、FS值均顯著下降（P＜0.01），提示CHF大鼠造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠手術8周后超聲心動圖結果比較（±s）

表1 兩組大鼠手術8周后超聲心動圖結果比較（±s）

注：與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別假手術組造模組n 3 3 LVIDd（mm）5.73±0.83 7.03±0.45△LVIDs（mm）3.03±0.47 4.67±0.49△△EF（%）83.67±3.21 58.33±4.51△△FS（%）47.33±3.79 27.00±3.00△△LVESV（μL）73.33±30.55 253.33±72.34△△LVEDV（μL）463.33±174.74 610.00±193.13

1.5 分組與給藥

造模成功后大鼠隨機分為模型組、卡托普利組和參竹心康湯組，加上假手術組，共4組。假手術組和模型組蒸餾水灌胃10 mL/kg；卡托普利組卡托普利混懸液灌胃7.8 mg/kg；參竹心康湯組參竹心康湯濃縮液灌胃44 g/kg。各組均每天給藥1次，持續6周。課題組前期實驗［5-6］表明參竹心康湯高劑量組改善心肌纖維化效果最優，因此本實驗參竹心康劑量設計為44 g/kg。

1.6 標本采集與檢測

給藥結束后將大鼠麻醉致死，取左心室分兩部分，一部分放于4%多聚甲醛溶液中固定，4℃保存。經乙醇脫水、石蠟包埋后切片，用于心肌病理學檢測。另一部分迅速冷藏存放于-80℃液氮中用于RT-PCR及Western blotting試驗。

1.6.1 Masson染色法觀察心肌病理變化 大鼠心肌石蠟切片常規脫蠟，按Masson試劑盒操作說明染色、無水乙醇沖洗、吹干、透明、封片，使用光學顯微鏡觀察心肌纖維化程度。

1.6.2 RT-PCR法檢測心肌miRNA-21含量 取大鼠心肌組織0.25 mg，按照Trizol試劑說明書提取心肌組織總RNA并使用紫外分光光度計測定其濃度，以組織總mRNA為模板，根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄cDNA，50℃孵育50 min，85℃孵育5 min，以檢測的基因引物進行實時定量PCR，取cDNA反應液1 μL進行擴增反應，擴增條件為95℃預變性10 min、95℃15 s、60℃30 s，經歷40個循環。反應結束后讀取Ct值，ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，-ΔΔCt=對照組ΔCt-各樣品 ΔCt，2-ΔΔCt反映各樣品相對于對照組樣品目的基因表達水平的比值。在網址http：//www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl?terms=214中搜索miRNA序列，運用Primer5軟件設計引物，由上海生工合成引物，引物序列見表2。

表2 引物序列

1.6.3 Western blotting檢測心肌PTEN的表達 取心肌組織0.025 g，完成蛋白提取后取5x蛋白上樣緩沖液50～200 μL蛋白上清中混勻，用沸水煮5 min后放入冰盒中冷卻備用，然后進行電泳，制備凝膠并轉膜，配制5%的脫脂奶粉，封閉90 min，孵育一抗，PTEN（1∶2 000），GAPDH（1∶3 000），4℃孵育過夜，洗膜后孵育二抗，HRP標記山羊抗鼠二抗（1∶5 000），HRP標記山羊抗兔二抗（1∶6 000），25℃孵育90 min，ECL化學發光液顯色曝光，掃描曝光后的底片，使用Quantity one專業灰度分析軟件對底片進行分析。

1.6.4 免疫熒光雙染檢測血小板-內皮細胞黏附分子（CD31）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達 將左室心肌石蠟切片脫蠟并水化，將切片浸入EDTA緩沖液（pH9.0），加熱后冷卻至室溫，用0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.6）洗滌3次，再依次置入硼氫化鈉溶液、蘇丹黑染液中漂洗，使用10%正常血清/5%BSA封閉60 min，依次滴加孵育稀釋的一抗、二抗，DAPI工作液37℃染核，PBS沖洗3次，緩沖甘油封片后避光保存，使用熒光顯微鏡（400倍）觀察，應用Image-Pro Plus5.1分析軟件，在相同的光學條件下測定表達CD31、α-SMA陽性細胞的積分光密度（IOD）值。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理改變

見圖1。假手術組心肌細胞之間僅有極少量藍染的膠原纖維；與假手術組相比，模型組心肌組織經染色后見可大量藍染的心肌膠原纖維呈網格狀包繞正常心肌細胞，大面積纖維化組織代替正常心肌組織；與模型組相比，卡托普利組和參竹心康湯組心肌組織中膠原纖維顯著減少，但較假手術組膠原纖維量仍有所增多。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變（Masson染色，400倍）

2.2 各組大鼠心肌miRNA-21表達水平比較

見表3。結果顯示，與假手術組比，模型組、卡托普利組、參竹心康湯組大鼠miRNA-21表達升高（P＜0.05）；與模型組比，卡托普利組、參竹心康湯組的miRNA-21表達顯著下降（P＜0.01），與卡托普利組比，參竹心康湯組miRNA-21表達顯著下降（P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌miRNA-21及PTEN表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌miRNA-21及PTEN表達水平比較（±s）

注：與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與卡托普利組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別n miRNA-21PTEN假手術組模型組卡托普利組參竹心康湯組7 7 7 7 1.20±0.22 6.74±0.70△△4.20±0.63△△#1.98±0.47△#**0.29±0.04 0.07±0.02△△0.12±0.02△△#0.18±0.03△△#**

2.3 各組大鼠心肌PTEN蛋白表達比較

見表3，圖2。與假手術組相比，模型組、卡托普利組、參竹心康湯組的PTEN蛋白表達顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，卡托普利組、參竹心康湯組PTEN蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與卡托普利組比，參竹心康湯組PTEN蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠心肌PTEN蛋白電泳圖

2.4 各組大鼠心肌細胞CD31、α-SMA表達比較

見表4，圖3。綠色熒光為內皮細胞標志物CD31陽性表達細胞，紅色熒光為間質細胞標志物α-SMA陽性表達細胞，藍色為DAPI染色的細胞核。結果顯示，假手術組中大量細胞表達CD31陽性，而僅有極少量細胞表達α-SMA陽性；模型組中則有大量細胞表達α-SMA陽性，僅有少量細胞表達CD31陽性，且模型組中CD31的表達較假手術組顯著減少（P＜0.01），α-SMA的表達較假手術組顯著增加（P＜0.01）；參竹心康湯組與卡托普利組中大量細胞表達CD31陽性，且CD31的表達較模型組顯著增加（P＜0.01）；僅有少量細胞表達α-SMA陽性，且α-SMA表達較模型組減少（P＜0.05）。

表4 各組大鼠心肌組織中CD31、α-SMA的表達比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中CD31、α-SMA的表達比較（±s）

組別假手術組模型組卡托普利組參竹心康湯組n 7 7 7 7 CD31 2 808.00±183.13 769.00±341.94△△2 366.29±296.44△△##2 050.57±265.11△△##*α-SMA 1 271.71±163.79 5 260.86±1 925.15△△1 792.57±277.72△△#1 814.71±281.58△△#

圖3 各組大鼠心肌CD31、α-SMA表達（免疫熒光，400倍）

3 討 論

心肌纖維化是心衰發展過程中的重要病理變化，是由多種病理因素導致的心肌組織中成纖維細胞異常激活，進而引起心臟間質成纖維細胞的異常增殖，細胞外基質及膠原纖維過量沉積，心臟間質重塑的一個過程［7］。EndMT是內皮細胞向間質細胞轉化的過程，在此過程中內皮細胞逐漸失去其特征性標志物，如CD31等，獲得間質細胞特征性標志物，如α-SMA等［8］。內皮細胞在解剖學上類似于鱗狀上皮，有基底極性并呈緊密連接狀態。在胚胎發育期間，來自心內膜的內皮細胞可以通過內皮間質轉化增加心臟瓣膜和心臟的隔膜、促進脈管和淋巴管內膜的形成［9］。而在病理狀態下，心肌組織中的內皮細胞可以通過內皮間質轉化轉變為成纖維細胞，并分泌細胞外基質相關膠原蛋白，這些物質的病理性積累可破壞正常心肌結構，造成心肌纖維化［10］。在壓力負荷誘導的心肌重構中，有27%～33%的成纖維細胞來源于發生內皮間質轉化的內皮細胞［11］，這就促進了心肌纖維化的發生發展。本實驗免疫熒光檢測中，CHF大鼠大量心肌細胞表達α-SMA陽性，僅有少量細胞表達CD31陽性，表明HF大鼠心肌纖維化程度與End MT成正相關。由此可見，End MT是心肌纖維化過程中的關鍵機制。

miRNA-21與心血管疾病的發展有著密切的關系［12］。miRNA-21在正常心肌中呈弱表達，但在心衰狀態下的心肌細胞中表達豐富，可以顯著抑制成纖維細胞的凋亡，促進心肌肥大和心肌纖維化。miRNA-21在心衰患者血清中濃度也會顯著升高［13］。miRNA-21的高表達會促進心肌纖維化的進展［14］。本實驗造模后，大鼠miRNA-21表達升高（P＜0.05），而干預后，卡托普利組、參竹心康湯組的miRNA-21表達顯著下降（P＜0.01）。PTEN 定位于染色體10q23.31上［15］，PTEN具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶的雙重磷脂酶活性，可以通過脂質磷酸酶的活性負向調節PI3K/Akt通路［16］。磷脂酰肌3-激酶（PI3K）是一種進化上保守的脂質磷酸激酶，可以通過產生PIP3來激活絲氨酸蛋白激酶Akt，Akt活化的功能形式是p-Akt，具有促進心肌成纖維細胞分裂增殖等作用。本實驗造模后，PTEN蛋白表達顯著減少（P＜0.01），而干預后卡托普利組、參竹心康湯組PTEN蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。miRNA-21可通過PTEN/Akt通路調控體內外內皮間質轉化過程［16-17］。敲除大鼠體內內皮細胞中的miRNA-21基因，心肌纖維化中α-SMA間質細胞的數目及Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的表達顯著減少，心肌纖維化的進程也得到延緩。miRNA-21通過PTEN通路在TGF-β1誘導EndMT中發揮作用［18］。

參竹心康湯由黨參、麥冬、黃芪、丹參、三七、澤蘭等藥物組成。方中黨參健脾益氣，令心氣生成有源，麥冬滋心陰養心血，二者共為君藥。黃芪助黨參培土生金，葶藶子使外滲之津得瀉，丹參、三七、姜黃、澤蘭活血化瘀，瘀血得化，新血得生，心體得養，共為臣藥。黃精上助黃芪補肺氣，中助黨參健脾益氣，下資腎臟益腎填精；五味子收澀外滲之津，玉竹養陰生津，佐助麥冬養心陰、生心血，同為佐藥。諸藥合用，心肺之氣充沛，陰血足而血脈充，瘀血化而血脈通，氣陰得補，瘀血得化，具有益氣養陰，活血化瘀之功效。前期研究表明參竹心康湯可以通過多種神經、體液途徑改善心衰心肌纖維化。其中主要成分從不同途徑實現抗心肌纖維化功能，如黃芪中的黃芪多糖通過抑制TGF-β1/Smads通路從而達到抑制心肌纖維化的作用［19］；麥冬可通過抑制TGF-β1、p-Smad2/3和Smad2/3蛋白表達改善大鼠心肌纖維化［20］；丹參素通過抗心肌纖維化改善急性心肌梗死，與抑制TGF-β/CTGF通路相關［21］；三七皂苷通過降低心房顫動大鼠血清和心房組織ICAM-1、TNF-α、MMP-2水平，升高TIMP-2水平抑制心肌纖維化［22］。本實驗研究提示，CHF大鼠心肌發生了明顯的纖維化改變。CHF大鼠心肌組織中miRNA-21的表達上升（P＜0.05），PTEN表達下降（P＜0.01），表明纖維化的心肌組織中miRNA-21基因負性調控了PTEN的表達。經參竹心康湯干預后，miRNA-21表達下降（P＜0.01），PTEN的表達上升（P＜0.01），大量細胞表達CD31陽性，且CD31的表達較模型組顯著增加（P＜0.01），僅有少量細胞表達α-SMA陽性，且α-SMA表達較模型組減少（P＜0.05），提示End MT逆轉。

總之，參竹心康湯可能通過抑制miRNA-21的表達調控PTEN/PI3K/Akt通路，從而抑制End MT，減輕心肌纖維化，治療心力衰竭。