艱難類梭菌表面蛋白研究進展

張慧敏(綜述)，李志榮，趙建宏(審校)

(河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000)

艱難類梭菌(clostridioides difficile,CD)是一種革蘭染色陽性，產芽孢的專性厭氧菌，其導致的艱難類梭菌感染(clostridiodes difficile infection,CDI)癥狀包括腹瀉、偽膜性腸炎、中毒性巨結腸等，嚴重者可導致死亡，近年來發病率和病死率逐漸增高[1]。CD通過芽孢經糞-口途徑進入人體或者作為正常寄居菌在腸道內定植，一旦腸道菌群失衡，CD將產生大量腸毒素A(toxin A of clostridoieds difficile A,TcdA)和細胞毒素B(toxin B of clostridoieds difficile,TcdB)，從而導致腹瀉等疾病癥狀[2-3]。因而介導定植的鞭毛、菌毛以及部分表面蛋白也作為毒力因子在CDI中起重要作用[4]。因此，研究CD表面蛋白的功能作用對CDI防治具有重要意義。本文就CD表面蛋白研究進展進行綜述。

1 S-層蛋白

許多原核生物會在菌體表面形成一個蛋白層，稱為S層(surface layer，S-layers)蛋白，其結構為一個規則的二維次晶陣列[5]。這些蛋白參與艱難類梭菌與宿主腸道細胞黏附，誘導免疫系統對菌體的識別，是重要的藥物作用靶點，包含了很多潛在的可用于藥物開發的信息。而且，由于S層蛋白位于菌體的最外層，在病原菌與宿主及其免疫系統的相互作用中也發揮著重要作用。艱難類梭菌的S層結構相較于其他細菌S層的特殊之處在于其二維晶體是由異質二聚體構成。slpA基因編碼的蛋白前體，在去除信號肽并分泌到細胞外后，由半胱氨酸蛋白酶Cwp84進行第二次裂解，釋放出高相對分子質量(high-molecular weight，HMW)和低相對分子質量(low-molecular weight，LMW)SLPs(S-layer proteins)。它們一起形成一個緊密結合的非共價H/L復合物，錨定在細胞表面并組裝成S蛋白層[6]。除SlpA外，S層蛋白還包含許多其他功能的表面蛋白，這些表面蛋白均為HMW SLP同源蛋白，統稱為細胞壁蛋白家族(cell wall proteins)。CD630菌株的全基因組測序分析顯示其共有28個HMW SLP同源基因，這些同源蛋白的共同特征為都具有N-末端信號肽和細胞壁結合結構域，這兩個結構之間的結構域的不同使艱難類梭菌S層具有廣泛的功能[6]。

1.1SlpA SlpA是艱難類梭菌S層的主要成分，是涉及艱難類梭菌與腸道黏液層相互作用的黏附素之一,HMW-SLP靠近細胞壁，在不同菌株之間高度保守，LMW-SLP靠近外側，在菌株之間高度可變，是誘導免疫反應的主要蛋白。SLPs可與Hep-2細胞、Vero細胞以及人類胃腸組織等結合。且去除SLPs或者將菌體與抗SLP抗體孵育會降低艱難類梭菌與HeLa細胞的黏附率。LMW-SLP可通過與宿主細胞表面表達的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)相互作用，誘導宿主的促炎免疫反應[7]。SLPs與宿主的天然或適應性免疫防御密切相關，使用來自小鼠骨髓和人樹突狀細胞的體外研究表明[7]，SLP可誘導樹突狀細胞成熟，進而激活T輔助細胞。因此，針對SLPs的主動或被動免疫可能成為治療艱難類梭菌感染的潛在治療方案。而且，使用抗SLP抗體對倉鼠進行被動免疫能夠顯著延緩艱難類梭菌感染的疾病進程，延長感染倉鼠的生存時間；在小鼠直腸內接種重組SlpA蛋白可明顯降低艱難類梭菌腸道定植率，且接種重組SlpA蛋白的小鼠糞便中特異性IgA的水平也高于對照組[8]。但是，目前基于SLP進行的免疫療法并不能完全防止艱難類梭菌的感染。

用小角度X射線散射研究顯示，H/L復合物表現為LMW-SLP的C端和HMW-SLP的N端連接在一起，形成一個類似于“回形針”排列，其中HMW亞單位的三個CWB2結構組成一個三角棱形[5]。SlpA是由SecA2分泌，之后經過蛋白酶修飾而發揮作用，這一過程需要在細胞壁中停留一定時間。Oatley等[9]認為，細胞壁中存在一個SlpA池，即S層是在肽聚糖的合成部位形成，并且在整個細胞壁上有SlpA的潛在供應源，且這個異二聚體的組裝可能需要細胞外的分子伴侶來幫助這一過程并促進定位，同時防止過早的自組裝或錯誤折疊，因此細胞壁中的SlpA池可能成為新的藥物靶標。尚沒關于分離到slpA突變株的報道，證明SlpA對于艱難類梭菌的生長至關重要，但有研究報道了兩株表型為SlpA缺失的突變株，其表現為嚴重的芽孢形成缺陷，以及對溶菌酶和抗菌肽LL-37的敏感性顯著增加。值得注意的是，盡管該突變株毒力顯著減弱，其依然能夠在小鼠腸道內定植[9]。

總之，對艱難類梭菌SLPs的結構及功能探索將加深對CDI致病機制的理解，為開發針對S層結構及功能的抗菌藥物提供了大量的可能性，并有助于開發疫苗和治療艱難類梭菌相關疾病的新治療方法。

1.2Cwp84和Cwp13 Cwp84和Cwp13都屬于半胱氨酸蛋白酶類，也是S層蛋白的重要組成部分。Cwp84負責切割SlpA形成HMW-SLP和LMW-SLP。將Cwp84編碼基因敲除后，細菌表面可以檢測到沒有被切割的SlpA，培養基中也可檢測到SlpA、Cwp2和Cwp66，這些蛋白在野生型中則檢測不到。敲除cwp84還會導致菌落形態異常，有聚集的傾向，生長速率也會降低。然而，敲除cwp84基因并不能防止CDI，這可能是由于宿主自身存在具有類似功能的蛋白酶，或是細菌存在其他替代機制。此外，最近的一項研究發現，在導致復發的菌株的生物膜模型中，Cwp84表達增高，這種現象在非復發菌株產生的生物膜中沒有觀察到，這表明Cwp84與復發感染有關[10]。雖然敲除cwp84基因不能防止CDI，但用Cwp84免疫過的倉鼠感染模型中，艱難類梭菌在腸道的定植率降低，總體生存率也有所提高[11]。在最近一項基因多態性分析中認為，cwp84雖然高度保守，但它的抗原性和免疫原性在表面相關蛋白中最低，表明Cwp84可能不是開發疫苗的合適目標[12]。Cwp13與Cwp84具有高度相似性，但與Cwp84不同的是，Cwp13的切割位點是在細胞壁結合結構域，這可能有助于去除錯誤折疊的蛋白質，確保S層具有完整功能。

1.3Cwp66 Cwp66屬于黏附因子蛋白，其功能區在菌株之間同源性較低，其C-末端結構域表面暴露并且在菌株之間高度可變，而N-末端結構域是保守的并且錨定在細胞壁中，該基因的缺失導致細胞黏附能力，細胞運動性和應力耐受性的降低[13]。在Cwp66正常表達水平情況下，抗Cwp66抗體不能降低艱難類梭菌在Vero細胞的黏附率，但菌體經60 ℃熱處理后，與抗Cwp66抗體孵育使得菌體的黏附能力降低，這表明抗Cwp66抗體對于艱難類梭菌黏附抑制存在特異性，即只對特定結構有作用，或是熱處理可引起CD細菌表面蛋白質構象的改變或斷裂，從而使Cwp66的黏附結構暴露可以與相應抗體結合。cwp66突變體還表現出比野生株對克林霉素，氨芐青霉素和紅霉素更敏感，但與野生株相比對萬古霉素和甲硝唑的耐藥性更高。

1.4CwpV(Cell Wall Binding V) CwpV存在于所有艱難類梭菌中，是CWPs中含量最多的蛋白。通過SecA2系統分泌到細胞表面，切割產生兩個肽段，按其相對分子質量不同，可將CwpV分為五種類型。CwpV可以介導細胞聚集，其過度表達會導致菌落變小、密集，反之會導致菌落增大、稀疏。CwpV還介導了具有相位可變性的噬菌體抗性，即當該酶基因轉錄時才能防止噬菌體的侵襲。這種相性變化是由于位于cwpV基因和啟動子之間的5′非翻譯區中存在一個表觀遺傳開關。在正常生長條件下，大多數細菌(95%)在開關內形成了一個不依賴Rho的轉錄終止器，防止下游cwpV基因的轉錄，處于“關閉”狀態，而在5%的細胞中，一個特定位點(RecV)的特異性酪氨酸重組酶催化了基因開關的反轉，從而破壞了轉錄終止子，并允許轉錄cwpV基因。但在艱難類梭菌流行株R20291中引入φCD38-2噬菌體后，95%的細胞表達該基因，但驅動相位變化的信號以及φCD38-2對這種調節功能的影響機制還需進一步研究[14]。而且有研究發現，盡管CwpV具有噬菌體抗性，噬菌體仍可以與細菌結合，但是在菌體中不能檢測到噬菌體DNA復制，這可能是由于CwpV通過干擾噬菌體DNA合成從而抵抗噬菌體侵襲。

1.5Cwp2和Cwp8 Cwp2(Cell Wall Binding 2)可通過低pH甘氨酸或溶菌酶等試劑提取，相對分子質量約為66 000，具有高度的免疫原性，但由于Cwp2在部分菌株中不表達，因此其相應抗體在這類菌株引起的CDI防治中不能發揮作用[5]。在倉鼠模型中，敲除艱難類梭菌cwp2基因對于菌株的生長、芽孢形成和引起CDI的能力沒有影響，但卻導致了TcdA水平增加，可能是與毒素表達有關的轉錄因子改變導致毒素表達增加，也可能是由于從S層去除Cwp2可能會導致細胞完整性下降而釋放增加，或兩者皆有。同時也表現出對Caco-2細胞的黏附能力受損，表明Cwp2作為黏附素的潛在作用。

Cwp8是一種功能區域與Cwp2高度相似的S層蛋白，每個CBW2圖案都承擔著拓撲異構體-初級酶的折疊，它們一起組裝成一個三葉草狀結構。基于蛋白質之間的相似性，推測其很可能也具有黏附性質[15]。總之，S層蛋白是艱難類梭菌表面最豐富的蛋白，大多由同源基因編碼，其功能包含黏附、切割、免疫等，與艱難類梭菌的生長繁殖緊密相關，也是免疫療法的重要潛在靶點，對S層蛋白的進一步研究對開發新療法具有重要意義。

2 鞭毛蛋白

2.1鞭毛的結構 除RT078型外，艱難類梭菌的多數型別都具有鞭毛結構。鞭毛結構包括分子馬達、鉤-基體復合體和旋轉絲狀體[16]。鞭毛是細菌毒力構成的一部分，通過以下幾方面參與致病：①促進對宿主細胞的黏附；②提供動力攝取營養物質；③促進生物膜的形成；④促進毒力因子跨細胞膜的轉移，屬于特殊III型分泌系統；⑤作為免疫調節劑，通過Toll樣受體5(TLR5)信號通路觸發促炎細胞因子。鞭毛結構由多種蛋白組成，目前已經在艱難類梭菌630和R20291菌株中已鑒定出多種控制鞭毛結構完整性和運動的基因和蛋白質，這些蛋白參與多項生物功能。控制CD630菌株鞭毛組裝的基因包括三個不同的操縱子，稱為F1、F2和F3調節子。F1區域編碼的鞭毛蛋白FliC和FliD的是形成完整功能鞭毛所必需的結構蛋白，艱難類梭菌FliC和FliD基因突變會導致艱難類梭菌鞭毛缺失且沒有動力。其中，FliC與毒素基因表達、細菌定植和毒力有關，并負責體內感染過程中的多效性基因調控[17]。實驗證明，與枯草芽孢桿菌類似，艱難類梭菌FliC由鞭毛組裝因子(FliW)和碳儲存調節劑A(CsrA)共同調節，CsrA負向調節fliC表達，而FliW通過抑制CsrA轉錄后調控間接影響FliC表達。

2.2鞭毛對毒力的影響 除運動和黏附外，鞭毛還可影響艱難類梭菌的毒力作用，且表現出相位變異性[11]。這種表型異質性是通過DNA重組酶RecV通過位點特異性重組實現的相位變化實現的，與CwpV類似，在鞭毛基因flgB的上游，存在一個154bp的編碼“開關”，當兩者在同一個方向上，flgB基因表達升高，表現為鞭毛的生物合成、游泳運動和毒素產生，反之，flgB操作子轉錄降低，細菌表現為無鞭毛，無運動能力，毒素水平降低。Dominika Trzilova等在研究中證實Rho因子是影響艱難類梭菌重要毒力因子相位變化的基因表達調節器[18]。

2.3鞭毛的免疫學功能 多項研究表明，FliC和FliD由于其保守性和誘導強烈免疫反應的能力，是與合適的佐劑一起用于疫苗的良好候選者。因此，有研究在計算機上利用PEPSCAN程序計算和預測鞭毛蛋白中適合免疫療法的抗原表位。FliC的兩個抗原表位中，117QRMRTLS123位于鞭毛內的TLR5結合區，可被患者的抗體所識別。但其顯示出與其他有鞭毛菌株免疫兔血清的高水平的交叉反應，能否成為合適的疫苗研發靶標還需進一步研究。另一個抗原表位是205MSKAG209，其位置暴露，易與抗體所結合[19]。FliD是一種高度保守的蛋白，具有鞭毛帽的功能。FliD同樣有兩個表位受到研究人員的關注，即分別位于“頭部”和“腿部”區域的226NKVAS230和306TTKKPKD312，該區域高度靈活，可能參與蛋白寡聚。這些區域定位的重要性以及它們在功能性鞭毛組裝方面的功能需要進一步研究。綜上，鞭毛蛋白在不同型別艱難類梭菌的黏附、運動和毒力中顯示了不同的影響。CD630菌株的黏附對鞭毛的依賴要低于R20291，而不同的鞭毛基因對毒素基因的調節也存在差異，鞭毛對艱難類梭菌的調節復雜且涉及到多個方面，還需要進一步的研究探討。

3 菌毛蛋白

菌毛也是一種廣泛存在于原核生物中的表面蛋白，在許多種屬中都存在。菌毛蛋白通常介導表面運動、細菌與宿主細胞和/或其他細菌的黏附以及生物膜形成[20]。在艱難類梭菌中，菌毛基因表達可促進其自動聚集，有助于CD630/630△erm和R20291形成生物膜，且該過程受c-di-GMP調節。本實驗室在探討艱難類梭菌不同型別表面蛋白表達差異的研究中，通過生物素標記提取膜蛋白并進行LC-MS/MS質譜分析顯示，RT027型菌株中存在特異的菌毛蛋白，而這種蛋白在RT017型菌株中未檢測到。值得注意的是，RT027與RT017具有不同的毒素表型和流行特點，RT027是歐美地區的主要流行菌株，而RT017(即ST37型菌株)是亞洲地區的優勢菌株。這兩種不同型別菌株的表面蛋白的差異可能與其特殊的致病性和流行性有關。

4 其他蛋白

4.1分選酶錨定蛋白 在許多革蘭陽性細菌中，表面蛋白通過分選酶的作用共價附著在細胞壁上。目前，已經有學者對革蘭陽性菌中具有不同功能的六個分選酶家族進行了研究，所有這些家族都識別不同的底物基序[21]。在艱難類梭菌中只發現了一個功能性的分選酶基因--CD2718。膠原結合蛋白CD2831和黏附素CD3246都通過分選酶附著到細胞壁上，并通過高度特異的蛋白酶PPEP-1(Zmp1/CD2830)的釋放。PPEP-1突變菌株在倉鼠感染模型中毒力明顯降低，表明其在黏附素相關調節中的重要性，并表明PPEP-1可作為潛在的抗菌藥物靶標。

4.2纖維連接蛋白 除了CWP家族和分選酶底物外，CD的許多其他表面蛋白可以通過與細胞膜的相互作用或通過某種未知結合機制定位于細胞表面。纖維連接蛋白結合蛋白(Fbp68/FbpA)屬于MSCRAMM家族，能夠與纖維連接蛋白和Vero細胞結合。Fbp68可能與艱難類梭菌的黏附定植有關，在感染小鼠模型中，Fbp68突變株在盲腸的定植率明顯降低。但與野生株相比，對Caco-2或HT29-MTX細胞黏附率沒有明顯差異。其在黏附定植過程中的作用還需進一步研究。此外，有研究發現CDI患者血清中含有抗Fbp68抗體，表明Fbp68可能是艱難類梭菌免疫療法的潛在靶標[11]。

4.3熱休克蛋白 熱刺激、低pH溶液和缺鐵均可以增加艱難類梭菌對組織細胞的黏附。GroEL是Hsp(heat shock protein)60伴侶蛋白家族的一員，它會在上述刺激反應中表達增加。艱難類梭菌與抗GroEL抗體共同孵育后，菌體在Vero細胞的黏附率顯著降低，也表明GroEL具有黏附功能。

綜上所述，艱難類梭菌表面蛋白對于艱難類梭菌的生存與感染致病極為重要，它不僅直接與宿主細胞相互作用，介導黏附定植和免疫反應，還影響細菌的毒素表達和代謝過程，是潛在的抗菌藥物作用靶標。S層蛋白作為艱難類梭菌主要的膜蛋白，包含多種類型和功能，是維持細菌生存的重要工具，也是治療CDI的重要突破點。鞭毛蛋白和菌毛蛋白是細菌重要的運動黏附器官，并影響了艱難類梭菌的毒力作用。種類豐富且功能復雜的表面蛋白的研究將進一步闡明艱難類梭菌致病機制，并有助于開發疫苗和治療艱難類梭菌相關疾病的新療法。