降鈣素基因相關肽對牙正畸移動微環(huán)境改建作用的研究進展

紀雅寧，錢素婷，丁玲敏，林 軍

Stomatology,2022,42(1):79-83

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是由神經(jīng)末梢分泌的一種神經(jīng)多肽，近年來，由于CGRP被發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)調控骨改建的關鍵因子并且與血管及膠原再生有關而備受關注[1]。早在1998年的研究[2]中就已證實，在牙正畸移動(orthodontic tooth movement, OTM)中，CGRP不僅可以傳遞給牙周膜(periodontal ligament，PDL) 和牙槽骨傷害性刺激，而且在響應OTM發(fā)生的神經(jīng)、血管、膠原及牙槽骨等的改建中也十分重要。生理狀態(tài)下CGRP陽性纖維約占全部感覺神經(jīng)的50%，而OTM微環(huán)境中CGRP的表達量增加且具有統(tǒng)計學意義[3-4]。正畸治療過程中，矯治器產(chǎn)生的力通過三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)的瞬時受體電位香草素1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)受體啟動CGRP的合成、囊泡運輸及分泌過程，CGRP水平上升，對OTM微環(huán)境的改建發(fā)生作用[5-6]，包括但不限于牙周神經(jīng)、膠原、血管及牙槽骨的新生。目前，關于CGRP調控OTM微環(huán)境改建的機制研究較少，現(xiàn)對其可能機制進行闡述。

1 CGRP及其受體的分子生物學特性

1.1 CGRP的分子生物學特性

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是降鈣素基因相關肽超級家族的成員之一，衍生自CALCA基因RNA轉錄物的可變剪接，由37個氨基酸組成。人類表達兩種形式的CGRP(α-CGRP和β-CGRP)，它們由11號染色體的不同位點轉錄而來，僅有3個氨基酸的不同，同源性超過90%，發(fā)揮著相似的生物學作用[7]。傳統(tǒng)上，人們認為α-CGRP是OTM微環(huán)境中的主要形式[8]。

CGRP主要位于C和Aδ感覺神經(jīng)纖維中，由神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞合成，通過軸漿運輸?shù)礁杏X神經(jīng)末梢，在細胞質內(nèi)以分泌顆粒的形式儲存。在OTM微環(huán)境中，CGRP主要由TG合成，隨著感覺神經(jīng)末梢廣泛分布于牙槽各處[9-10]，呈血管周圍定位性及骨代謝活躍區(qū)定位性特征性分布[11]。上述產(chǎn)生及分布特點為CGRP對OTM微環(huán)境中骨、血管、神經(jīng)及膠原的調控提供了先天的優(yōu)勢。

1.2 CGRP受體的分子生物學特性

功能最佳的CGRP受體由兩部分結構構成，一部分為G蛋白耦聯(lián)降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor, CRLR)和受體活性修飾蛋白-1(receptor activity modifying protein-1, RAMP-1)組成的異二聚體，另一部分為受體成分蛋白(receptor component protein, RCP)[12]。

在OTM微環(huán)境中，矯治器產(chǎn)生的力刺激三叉神經(jīng)(trigeminal nerve, TN)神經(jīng)末梢以旁分泌形式釋放CGRP至OTM微環(huán)境中，與CGRP受體結合，啟動下游信號傳導通路，在產(chǎn)生疼痛的同時發(fā)揮其生物學調節(jié)作用[13]。

2 CGRP對OTM中牙槽骨改建的作用

2.1 CGRP對OTM微環(huán)境中干細胞的作用

牙源性干細胞(dental stem cells，DSCs)主要為間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs),來自于胚胎發(fā)育過程中的中胚層，具有多向分化潛能，是目前組織工程及再生醫(yī)學的研究熱點[14]。其中與OTM牙槽骨改建相關的且表達CGRP受體的牙源性干細胞主要是骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)及牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)[15]。

2.1.1 CGRP促進BMSCs成骨分化及遷移 目前，大家普遍認同BMSCs可以通過Wnt/β-Catenin、BMPs/Smad、TGF-β/STAT信號通路等來調控成骨細胞分化[16]。在對牙槽骨的研究中， Liu等[17]在CGRP缺乏影響牙槽骨內(nèi)種植體骨結合的研究中發(fā)現(xiàn)，下牙槽神經(jīng)切除術導致的CGRP缺乏會使種植體周圍成骨受到抑制，且這一過程由經(jīng)典的Wnt/β-Catenin通路傳遞，即CGRP通過PKA信號傳導激活糖原合酶激酶-3b(GSK-3b)導致β-Catenin核轉運，促進BMSCs的成骨分化及成骨細胞的增殖，進而完成牙槽骨的重塑。王飛及Zhang等[18-19]在體外實驗中證明CGRP促進BMSCs成骨分化與Hippo通路有關，CGRP能夠上調p-Mst1/2表達,通過效應分子Yap/Taz完成信號的轉達。基于目前研究證據(jù)可分別證實OTM微環(huán)境中CGRP表達上調和高表達的CGRP可通過經(jīng)典Wnt/β-Catenin通路與Hippo通路等促進BMSCs成骨分化進而加速局部牙槽骨改建，但尚缺乏連續(xù)性實驗進一步證明CGRP對OTM局部微環(huán)境BMSCs的作用。Jia等[20]還發(fā)現(xiàn)CGRP給藥可以使下頜牽張成骨(mandibular distraction osteogenesis，MDO)大鼠模型中的BMSCs遷移能力增強。實驗中，成骨相關基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和核心結合因子2(runt-related transcription factor2，RUNX2)表達上調， 基質細胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)表達亦上調。而同期針對SDF-1的實驗[21]證明，SDF-1既可招募并促進 BMSCs成骨分化又可促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)等的表達，可以推測 CGRP通過上調成骨細胞表達 SDF-1 招募并促進 BMSCs 成骨分化加速骨改建，同時與微循環(huán)改建相關聯(lián)，但目前亦沒有具體且連續(xù)性的實驗對此進行證明。

2.1.2 CGRP促進PDLSCs成骨分化 PDLSCs是一類具有自我更新能力、多能性和免疫調節(jié)作用的MSCs，不僅可以向同胚層骨樣細胞，脂肪樣細胞增殖分化，而且可以向外胚層來源的神經(jīng)元細胞，施萬細胞等分化[22]。在OTM中，正畸矯治力可以通過Piezo 1受體及細胞骨架等傳遞給PDLSCs，也可以通過TG的TRPV1受體啟動CGRP的合成和分泌傳遞[23-25]。王芳等[26]的體外研究證實，CGRP對人PDLSCs成骨分化和成血管能力有正向促進作用，且其與mTOR信號通路有關。除此以外，王林等[24]研究發(fā)現(xiàn)OTM中促進PDLSCs成骨分化的激活通路還包括Notch1， OTM微環(huán)境中的PDLSCs上調了ALP、Runx2、OCN等成骨相關基因的表達，促進了成骨，但關于CGRP在其中的地位未進行證實。PDLSCs作為組織再生領域的新興研究熱點，針對其的研究相對較少，CGRP促進其成骨的研究亦十分缺乏，具體機制尚需研究者們進一步發(fā)掘。

2.2 CGRP對成骨細胞和破骨細胞的作用

成骨細胞胞膜上存在CGRP受體在多年前就已被報道，提示CGRP對成骨細胞有直接作用[27]。

He等[28]從體外實驗證實CGRP抑制了OPG/RANKL調控的破骨細胞生成。將成骨細胞與CGRP、CGRP拮抗劑分別孵育，時間到達后檢測發(fā)現(xiàn)CGRP處理組核因子κB配體受體活化劑(RANKL)的表達呈劑量依賴性下調，通過加入CGRP拮抗劑可以逆轉該趨勢。同樣Yu等[29]的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)CGRP處理組小鼠在2周時就可檢測到 ALP、BSP和RUNX2 等的表達上調。OPG/RANKL比值亦上調，從而較對照組觀察到更多的礦化結節(jié)。除此之外，Wu等[30]發(fā)現(xiàn)了CGRP可誘導成骨細胞中環(huán)狀RNA(circRNAs)mm9_circ_009056表達的上升以及miR-22-3p的表達減少，進而通過BMPs/Smad 及Wnt/β-Catenin途徑提高BMP7、RUNX2的基因和蛋白質水平來加強成骨，抑制破骨，即CGRP表達上調可明顯提高成骨細胞的成骨能力。也有研究證實CGRP可通過增強了 BMP2 表達水平促進成骨[31]。

CGRP還可促進成骨細胞自噬[32]，通過細胞內(nèi)雙層囊泡結構的自噬小體吞噬細胞自身蛋白質或細胞器，實現(xiàn)成骨細胞本身的代謝需要和細胞更新，是促進成骨細胞成骨分化的重要調控機制[33]。一方面成骨細胞自噬可促進成骨細胞分化，抑制OPG / RANKL信號通路進而抑制破骨細胞生成。另一方面通過自噬囊泡運輸磷灰石晶體促進局部成骨[34]。

CGRP在OTM微環(huán)境中可以調節(jié)成骨細胞與破骨細胞的動態(tài)平衡，促進成骨細胞分化及成骨，抑制破骨細胞形成逐漸成為了研究者們的的共識。

3 CGRP促進OTM微環(huán)境中微血管擴張和再生

CGRP受體廣泛分布于OTM微血管系統(tǒng)中，始終表達于血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)及血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells， VEC), CGRP與微血管中的受體結合，不僅可擴張微血管，也同時促進了微血管再生。

研究顯示，CGRP作為血管擴張劑，是前列腺素的10倍以上[35]。CGRP可以通過2種方式介導這種反應：①直接激活其在VSMC的受體并通過Gs-AC-cAMP-PKA通路使K+外流，通過細胞內(nèi)Ca2+濃度降低來介導舒張;②直接激活其在VEC的受體并通過Gs-AC-cAMP-PKA通路以增強NO的產(chǎn)生，NO可以擴散到血管平滑肌中，通過Gc激活介使K+外流，細胞內(nèi)Ca2+濃度降低來介導舒張[36-37]。VSMC和VEC具有獨立但互補的作用，共同對微循環(huán)中血管的擴張起促進作用。

Mi等[38]構建了大鼠牽張成骨模型，在牽張階段結束時，CGRP組內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的比例和牙槽骨缺損中的毛細血管密度顯著上升。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CGRP通過激活PI3K / AKT信號通路使BMSCs向 EPCs分化。此外，分化的EPCs迅速組裝成管狀結構并促進BMSC的成骨分化。Guo等[39]用鏈球菌素構建出了糖尿病大鼠模型并在其頭骨植入鈦，CGRP組同對照組及假實驗組相比VEGF的mRNA表達上升。后續(xù)相關實驗結果提示CGRP在Y397位點促進了局灶性粘附激酶(focal adhesion kinase, FAK)升高，通過CGRP-FAK-VEGF信號軸導致VEGF的表達變化[40]。 VEGF被認為可以強效地促進VEC的增殖分化以誘導促進新血管的形成。關于OTM張力側微環(huán)境中血管的改建是否符合這一規(guī)律尚未有學者進行研究，對此需要進一步驗證。

隨著新血管生成，OTM微環(huán)境中血供增加，骨及神經(jīng)改建過程中所需的O2及其他營養(yǎng)物質得以滿足，過程中產(chǎn)生的CO2及其他代謝產(chǎn)物得以排出，對OTM造成的局部微環(huán)境改建產(chǎn)生推進作用。

4 CGRP對OTM微環(huán)境神經(jīng)改建的作用

CGRP是外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)再生中不可或缺的組成部分，軸突再生與其密切相關。Wang等[6]構建的大鼠OTM模型中，TG中有1 279個差異表達基因，包括 Atf3、Adcyap1、Bdnf 和 Csf1 的上調以及 Scn10a、Kcna2、Kcnj10 和 P2ry1 的下調，產(chǎn)生類似于神經(jīng)損傷的轉錄組變化，不僅在 TRPV1 陽性神經(jīng)元中，而且在整個 TRPV1 陰性神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞中啟動正畸力作用后軸突損傷的主動再生程序。

Gomez-Sanchez等[41]提出了髓鞘吞噬(myelin phagocytosis)的概念，OTM微環(huán)境中CGRP表達上調可導致轉錄因子c-Jun上調啟動MAPK信號通路，從而誘導有髓鞘的和無髓鞘的施萬細胞(Schwann cell,SC)脫分化為有助于髓鞘清除的細胞，便于巨噬細胞(macrophages，ME)侵襲和促進軸突生長。Chung等[13]在上述研究基礎上進一步提出，SC也會在Notch和JAK-STAT信號轉導下分脫分化，以促進髓鞘碎片形成。從近端開始，SC沿著軌道生長，以軸突生長。SC的髓鞘吞噬會反過來造成CGRP的上調形成神經(jīng)再生的正反饋。除此以外，這種高度協(xié)調的運動是由成纖維細胞通過EphrinB/EphB2信號傳導部分控制的，這限制了SC的自我排斥行為，從而允許足夠的粘附發(fā)生遷移。

5 CGRP對OTM微環(huán)境膠原改建的作用

上世紀末，CGRP已被證明可以激活MAPK，MAPK磷酸化后通過PKA依賴性和非依賴性途徑促進PDLSCs向成纖維細胞的分化[42]，增殖分化而來的成纖維細胞不斷地在OTM微環(huán)境中合成膠原纖維。 Feng等[43]構建的大鼠OTM模型中壓力側PDLSCs的I型膠原(type Ⅰ collagen ，Col-Ⅰ)表達受到抑制，壓力消除后表達恢復。該過程通過轉化生長因子-β(TGF-β)來調節(jié)，阻斷TGF-β抑制PDLSCs中已恢復的Ⅰ型膠原Col-Ⅰ表達，可以抑制早期復發(fā)，即PDLSCs通過TGF-β/ Smad通路調控OTM微環(huán)境中的膠原重塑。

6 總結及展望

基于目前研究證據(jù)，CGRP對微環(huán)境的可能作用機制如下：①招募BMSCs至OTM微環(huán)境中并通過Wnt/β-Catenin、Hippo信號通路等促進BMSCs成骨分化，通過PI3K / AKT信號通路促進BMSCs 成血管分化；②通過mTOR及Wnt /β-Catenin、MAPK、Notch1信號通路促進PDLSCs成骨分化，通過MAPK、TGF-β/ Smad信號通路促進PDLSCs成纖維分化，通過mTOR信號通路促進PDLSCs成血管分化；③通過OPG / RANKL， BMPs/Smad 及Wnt/β-Catenin通路抑制破骨分化；④通過成骨細胞自噬促進成骨分化及局部成骨；⑤通過PKA途徑擴張微血管，通過CGRP-FAK-VEGF信號軸上調VEGF促進微血管增殖；⑥通過MAPK信號通路促進SC的髓鞘吞噬促進軸突伸長。

目前對于CGRP調控OTM微環(huán)境改建具體機制的研究仍然較少，CGRP在OTM中如何控制局部微環(huán)境的組織改建以及其中神經(jīng)、血管、膠原及牙槽骨等組織的改建之間如何建立聯(lián)系尚待進一步研究。