基于網絡藥理學和分子對接技術探討人參、丹參、葶藶子治療慢性心力衰竭的分子機制

黎燚華，陳 琦，康 亮，張志敏，趙新軍，李 榮

慢性心力衰竭是指心臟結構和/或功能的異常，使心室收縮和/或舒張功能發生障礙，從而引起的一組復雜臨床綜合征。現代醫學在心力衰竭治療中常用的藥物包括強心劑、利尿劑、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑等。強心劑與利尿劑可改善病人血流動力學，快速改善心力衰竭癥狀。ACEI/ARB、β受體阻滯劑及醛固酮受體拮抗劑可以抑制心室重構，延緩心力衰竭進展[1]，被稱為治療心力衰竭的“金三角”藥物。盡管如此，心力衰竭易損期的死亡率和再入院率仍舊居高不下，是目前心血管領域亟待攻克的難題。

越來越多研究表明，中醫藥在治療心力衰竭的過程中可發揮網絡作用，具有多靶點、多通路的特點。中醫認為，心為“君主之官”“主身之血脈”，若諸類病因影響及心，致心氣虛弱，心氣虛則其行血功能下降，氣不行血，血行不暢則致血瘀。血瘀會導致機體各部分受精氣充養減少而出現功能異常。當肺、脾、腎等主管機體水液代謝的臟腑出現功能失調時，則出現水液不化，產生水飲之邪留于體內。瘀和水是心力衰竭最常見的病理產物，兩者同屬陰邪，瘀水互結，易進一步損傷心氣，最終損及心陽、心陰，氣血衰敗，發展為心力衰竭。由此可見，心力衰竭的病機為本虛標實，本虛包括心氣虛、心陽虛、心陰虛，標實多為血瘀、水停。標本俱病，虛實夾雜。心氣虛是心力衰竭發病的始動環節，血瘀、水停為最常見的病理產物，同時又可作為致病因素進一步損傷心氣，形成惡性循環[2]。

心力衰竭的治療關鍵在于截斷病機中的惡性循環，此過程中的中醫治療需遵循“補虛瀉實”的原則。針對心力衰竭“虛”“瘀”“水”三位一體的本虛標實病機，廣州中醫藥大學第一附屬醫院心血管科李榮教授提出，在心力衰竭的治療中當標本同治，善用補氣、活血、利水三大法則，以“補氣藥、活血藥、利水藥”構建中醫治療心力衰竭的“藥物金三角”[3]。李榮教授認為，補氣可補充心臟動力、恢復心臟正氣、提升心臟功能，是保障心主血脈的功能正常發揮的基礎。同時兼以活血、利水之法，前者是截斷心力衰竭病機中不良循環的關鍵，后者則是祛除病理產物的重要手段。眾多臨床研究表明，中醫“藥物金三角”對于心力衰竭具有顯著療效，但其中的分子機制尚未被闡明。因此，本研究利用網絡藥理學及分子對接技術，基于中醫“藥物金三角”的代表性藥物人參、丹參、葶藶子，探討其治療心力衰竭的分子機制。

1 資料與方法

1.1 中醫“藥物金三角”成分搜集與靶點預測 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)[4]數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索人參、丹參、葶藶子的化學成分，并利用該數據庫推薦的口服生物利用度(OB)≥20%和類藥性(DL)≥0.1進行潛在活性成分的篩選。隨后下載篩選后的潛在活性成分的＊.mol2格式3D結構文件，利用Open Babel 3.1.1軟件將＊.mol2文件轉換為簡化分子線性輸入規范(simplified molecular input line entry system，SMILES)。接著利用SEA[5]數據庫(https://sea.bkslab.org/)和HITPICK[6]數據庫(http://mips.helmholtz-muenchen.de/hitpick/cgi-bin/index.cgi?content=targetPrediction.html)對潛在活性成分進行靶點預測。

1.2 心力衰竭致病基因搜集 分別利用“heart failure”“congestive heart failure”和“chronic heart failure”作為檢索詞在GeneCards[7]數據庫(https://www.genecards.org/)、CTD[8]數據庫(http://ctdbase.org/)和DrugBank[9]數據庫(https://go.drugbank.com/)檢索并獲取心力衰竭的致病基因，對其結果進行整合。

1.3 藥物對心力衰竭作用靶點的篩選 利用在線韋恩圖工具Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取所有藥物與心力衰竭的作用靶點，將其命名為“映射靶點”。隨后分別獲取補氣藥、活血藥和利水藥與心力衰竭的作用靶點。

1.4 映射靶點的蛋白互作分析及網絡構建 利用STRING[10]數據庫(https://string-db.org/)對藥物作用于心力衰竭的靶點進行蛋白-蛋白互作(PPI)分析，并利用Cytoscape 3.7.2軟件[11]對PPI關系進行可視化分析和網絡拓撲學分析。

1.5 藥物對心力衰竭作用靶點的富集分析 將藥物對心力衰竭的作用靶點提交至STRING網站中進行富集分析，包括基因本體(GO)的生物過程富集分析(GO-BP)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析，使用Cytoscape 3.7.2軟件構建“成分-靶點-通路”網絡。

1.6 分子對接分析 從PDB[12]數據庫中獲取受體蛋白的＊.pdb格式3D結構文件，利用ADT軟件對蛋白進行去除水分子、加極性氫、計算電荷、確定對接口袋，并輸出為＊.pdbqt格式文件，作為分子對接的受體庫。使用Raccoon軟件[13]對潛在活性成分的＊.mol2格式3D結構文件進行批量預處理，輸出保存為＊.pdbqt格式文件，作為分子對接的配體庫。隨后使用Autodock Vina[14]對受體及配體進行半柔性對接。

2 結 果

2.1 藥物成分 在TCMSP數據庫中共檢索獲得人參成分190個、丹參成分202個、葶藶子成分68個，經過OB及DL篩選，共獲得藥物潛在活性成分187個，其中人參潛在活性成分66個，丹參潛在活性成分97個，葶藶子潛在活性成分24個。部分潛在活性成分及其參數見表1。

表1 部分潛在活性成分的相關信息

2.2 藥物靶點及心力衰竭致病基因 經過SEA及HITPICK數據庫預測，共獲得藥物對應靶點455個，其中人參靶點341個，丹參靶點287個，葶藶子靶點264個。另外，從GeneCards、DrugBank、CTD數據庫中共獲得心力衰竭致病基因710個。通過構建韋恩圖，發現人參、丹參、葶藶子分別通過69個、63個和61個靶點作用于心力衰竭。經過去重，發現這3種藥物共通過97個靶點作用于心力衰竭，這97個靶點被定義為映射靶點。利用STRING網站對映射靶點進行PPI網絡分析，隨后利用Cytoscape 3.7.2對結果進行拓撲分析以獲取節點的度值(Degree)。節點在網絡中越重要，則節點的Degree越大。該網絡中共包含87個靶點、598個相互作用關系，平均度值為6.87。其中腫瘤壞死因子(TNF，Degree=26)、血管內皮生長因子 A(VEGFA，Degree=24)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3，Degree=23)、絲裂原激活的蛋白激酶8(MAPK8，Degree=22)、清蛋白(ALB，Degree=22)等靶點是映射靶點中的關鍵靶點。詳見圖1。

圖1 映射靶點PPI網絡圖

2.3 富集分析

2.3.1 映射靶點 利用在線網站STRING對映射靶點進行GO-BP和KEGG富集分析。結果顯示，映射靶點共富集到GO-BP條目1 116條、KEGG條目144條。其中，排名前30位的GO-BP及KEGG條目見圖2、圖3。可見，人參、丹參、葶藶子在治療心力衰竭時涉及對化學物質的反應(GO：0042221)、對藥物的反應(GO：0042493)、炎癥應答(GO：0006954)、對外部刺激的反應(GO：0009605)、對激素的反應(GO：0009725)等主要的生物過程以及糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路(hsa04933)、環磷酸腺苷(cAMP)信號通路(hsa04024)、胰島素抵抗(hsa04931)、白介素-17信號通路(hsa04657)、Toll樣受體信號通路(hsa04620)等關鍵通路。

圖2 映射靶點GO-BP通路富集分析(前30位)

圖3 映射靶點KEGG通路富集分析(前30位)

2.3.2 人參、丹參、葶藶子靶點 為了探討補氣、活血、利水藥物在治療心力衰竭中的異同，對3類藥物作用于心力衰竭的靶點分別進行了KEGG通路富集分析。結果顯示，人參、丹參、葶藶子作用于心力衰竭的靶點富集所得KEGG通路條目的數量分別為83個、107個和94個。利用韋恩圖對3類藥物的KEGG通路條目進行分析，發現3類藥物在治療心力衰竭時涉及了共同的通路，同時3類藥物具有各自獨特的通路。詳見圖4。

圖4 中醫“藥物金三角”作用于心力衰竭的靶點的KEGG通路分析

其中，3類藥物共有的關鍵KEGG通路包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(hsa04933)、cAMP信號通路(hsa04024)、Toll樣受體信號通路(hsa04620)、白介素-17信號通路(hsa04657)等；人參獨有的關鍵通路有凋亡-多個物種(hsa04215)、皮質醇的合成和分泌(hsa04927)等；丹參獨有的關鍵通路包括Rap1信號通路(hsa04015)、肌動蛋白細胞骨架的調節(hsa04810)、酪氨酸激酶(JAK)-信號轉導子和轉錄激活子(STAT)信號通路(hsa04630)等；葶藶子獨有的關鍵通路包括心肌收縮(hsa04260)、心肌細胞中的腎上腺素能信號(hsa04261)、醛固酮的合成和分泌(hsa04925)等；此外，在人參與葶藶子共有的通路中包括NOD樣受體信號通路(hsa04621)、醛固酮調節的鈉重吸收(hsa04960)、環磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路(hsa04022)等。這些通路都與心力衰竭的發生發展具有密切關系。

2.4 “成分-靶點-通路”網絡的構建 以“heart failure”為檢索詞，在MalaCards[15]數據庫(https://www.malacards.org/)中檢索與心力衰竭相關的通路，共獲得與心力衰竭密切相關的13個信號通路，其中包含了前面獲得的5個信號通路，分別為cAMP信號通路(hsa04024)、心肌收縮(hsa04260)、心肌細胞中的腎上腺素能信號(hsa04261)、醛固酮的合成和分泌(hsa04925)、cGMP-PKG信號通路(hsa04022)。這5個信號通路中共包括14個靶點，對應于52個潛在活性成分。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-成分-靶點-通路”網絡，詳見圖5。通路之間通過1個或多個靶點形成相互聯系，而1個靶點又可對應于來自不同藥物的多個活性成分。因此，中醫“金三角藥物”可以通過多成分對應多靶點，對多個心力衰竭的重要通路產生影響，形成一個復雜網絡關系，從而發揮治療作用。

圖5 “成分-靶點-通路”網絡

2.5 分子對接分析 為了探討“成分-靶點-通路”網絡中靶點與潛在活性成分的作用關系，選取人參、丹參、葶藶子的共同靶點(ABCC4、NFKB1、PPARA)與52個潛在活性成分進行半柔性分子對接。

2.5.1 對接相關信息 由于PDB數據庫中無ABCC4相關信息，故使用SWISS-MODEL[16]數據庫(https://swissmodel.expasy.org/)進行同源建模以獲取ABCC4的3D結構文件。隨后利用PROTEINS PLUS[17]網站(https://proteins.plus/)進行口袋預測以獲取對接口袋。詳見表2。

表2 受體基本信息與對接口袋數據

2.5.2 分子對接結果 分子對接結果顯示，NFKB1、PPARA、ABCC4與52個潛在活性成分的結合能均小于0，最高為-15.062 kJ/mol，最低為-41.422 kJ/mol，總平均結合能為-29.246 kJ/mol。NFKB1、PPARA、ABCC4與潛在活性成分的平均結合能分別為-24.267 kJ/mol、-30.543 kJ/mol和-33.054 kJ/mol。另一方面，與3個受體結合最好的潛在活性成分為蝙蝠葛堿(MOL001965)、丹酚酸J(MOL007142)、異丹參酮Ⅱ(MOL007111)、茯苓甾醇(MOL001659)、吳茱萸苷(MOL003909)等。詳見表3。

表3 分子對接結果

3 討 論

本研究使用網絡藥理學方法及分子對接技術，對中醫“藥物金三角”治療心力衰竭的分子機制進行了闡釋。研究結果表明，中醫“藥物金三角”的代表藥物人參、丹參、葶藶子可通過97個靶點作用于心力衰竭，其中TNF、VEGFA、STAT3、MAPK8、ALB等為關鍵靶點。相關研究表明，慢性過表達TNF會引起心肌肥厚、心肌細胞凋亡、心臟射血分數降低等，促進心力衰竭發展[18]。VEGFA參與心血管的形成、內皮細胞的遷移與活化等，在失代償心力衰竭的心臟中，可觀察到VEGFA的表達降低，提示VEGFA是心力衰竭的一個潛在治療靶點[19]。STAT3對于維持心臟的正常功能具有重要作用，內源性正常水平的STAT3可減輕心臟肥大，但STAT3在心肌細胞中過表達或缺失都會引起心肌肥厚及心臟纖維化，促進心力衰竭的發展[20]。MAPK8是絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的成員，是血管緊張素Ⅱ以及腎上腺素能激動劑促進心肌細胞肥大過程的重要機制[21]。ALB是調節血漿膠體滲透壓的關鍵物質，同時還是外源性藥物的在體蛋白，其水平對于心力衰竭轉歸具有優良的預測價值[22]。GO-BP表明，映射靶點參與機體對化學物質的反應、對藥物的反應、炎癥應答、對外部刺激的反應、對激素的反應等生物過程。

此外，本研究還從通路層面闡述了中醫“藥物金三角”治療心力衰竭的機制。通路富集分析表明，cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路、心肌收縮、心肌細胞中的腎上腺素能信號、醛固酮的合成和分泌是中醫“藥物金三角”治療心力衰竭的關鍵信號通路。cAMP與cGMP屬于第二信使，是心臟功能的重要調節因子，cAMP是由兒茶酚胺刺激G蛋白偶聯受體的腺苷酸環化酶而產生的，可通過下游的蛋白激酶A(PKA)調節心臟收縮與舒張的強度和頻率。cGMP是在鳥苷環化酶受到一氧化氮和利鈉肽的作用后產生的，可通過激活其下游效應蛋白激酶G和環核苷酸門控通道調節心臟收縮力和代謝反應[23]。cAMP與cGMP在功能上常常表現出對心臟的相反作用，且兩者之間存在密切的相互調節。此外，研究表明，cAMP信號通路在心力衰竭發展過程中具有抑制心肌肥厚的作用[24]。cGMP可作為利鈉肽物質的第二信使，可調節心肌收縮力、發揮排鈉利尿的作用，還可減弱兒茶酚胺類物質對心臟的刺激作用，抑制心肌重構[25]。在人類的心臟上，β1受體是主要的腎上腺素能受體，當其被激動時可使心臟產生正性變時和正性變力效應，這是心力衰竭初期心臟代償的重要途徑。但長期、慢性的β1受體激動對心臟是有害的，可誘導心肌肥大甚至細胞凋亡。由腎上腺皮質分泌的醛固酮具有保鈉保水的作用，與腎素、血管緊張素構成腎素-血管緊張素-醛固酮系統，在心力衰竭初期可通過增加心臟后負荷而保證相對穩定的心輸出量，但長期的醛固酮水平增加會啟動心肌肥大和間質纖維化的病理過程[26]。分子對接結果表明，這些關鍵通路中的靶點與藥物潛在的活性成分具有良好的結合活性，佐證了中醫“藥物金三角”可通過干預這些重要靶點與關鍵通路，發揮治療心力衰竭的作用。

綜上所述，中醫“藥物金三角”治療心力衰竭涉及了多成分、多靶點、多通路，以復雜網絡的形式調控心力衰竭時心肌收縮、心臟負荷、心室重構等生理病理過程，這為進一步的研究提供了方向。