柯薩奇病毒B3誘導病毒性心肌炎小鼠心肌細胞焦亡的實驗研究

趙洋洋，高吊清，劉 菲，武 鑫，賈旭林

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一種以心臟炎癥為特征的心血管疾病，多見于兒童和青少年，柯薩奇病毒B3(Coxsachie virus B3，CVB3)是最常見的病原體，其可導致心肌壞死，誘導心力衰竭和擴張性心肌病，嚴重者可危及生命[1]。近年來研究發現，在CVB3感染心肌細胞的過程中發現了兩種程序性死亡方式，一種是依賴于半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和p53活化的細胞程序性死亡方式即細胞凋亡，另外一種是依賴 Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導的一種程序性細胞死亡即細胞焦亡，細胞焦亡是高度炎癥性的程序性細胞死亡方式，其形態具有壞死和凋亡的特征[2-3]。已有研究發現，細胞焦亡在單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)誘導的病毒性心肌炎細胞模型中被激活，參與其病理過程[4]。細胞焦亡在許多炎癥性疾病的發生發展中起著至關重要的作用，但其在CVB3所致的病毒性心肌炎發病機制中的作用尚不明確。本研究采用CVB3感染構建病毒性心肌炎小鼠模型，探討CVB3可否通過誘導小鼠心肌細胞焦亡促進心肌炎的進展。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株 Hep2 細胞購于中喬新舟生物科技有限公司。CVB3 Nancy 株購于 ATCC。

1.2 動物 6周齡Bal b/c雄性小鼠30只(山西醫科大學實驗動物中心提供)，體質量16～20 g。

1.3 實驗材料 兔抗小鼠Caspase-1、半胱天冬氨酸蛋白酶原(pro-Caspase-1)單克隆抗體購于Abcam；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)均購于Bioworld；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、擴增試劑盒均購于TaKaRa公司；Caspase-1、NLRP3購自華大基因(NLRP3正向引物：5′-CGAGACCTCTGGGAAAAAGCT-3′，反向引物：5′-GCATACCATAGAGGAATGTGATGTAC-3′；Caspase-1正向引物：5′-TGGTCTTGTGACTTGGAGGAC-3′，反向引物：5′-GGTCACCCCTATCAGCAGTGG-3′；GAPDH正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；反向引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′)。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購于江萊生物。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 將30只小鼠分為對照組(10只)和實驗組(20只)，對照組腹腔注射0.1 mL無菌生理鹽水，實驗組每只小鼠腹腔注射0.1 mL含105半數組織培養感染劑量(TCID50)CVB3病毒液，分別于感染后的第3天、第7天隨機選取10只小鼠處死，收集小鼠全血及心臟組織。

1.4.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測NLRP3炎性小體及 Caspase-1 mRNA表達水平 取各組不同時間點心臟組織，按照說明書提取心肌組織中總RNA，測定總RNA濃度及純度，進行逆轉錄和擴增。以 GAPDH 為內參，計算各組目的基因的2-△△CT值。

1.4.3 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白水平 取各組小鼠心臟組織，超聲粉碎組織，冰上裂解提取蛋白， 10 000×g離心10 min，取上清測定蛋白含量并配平。配膠上樣后經電泳轉膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，對應抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育，TBST洗膜3次。利用凝膠成像系統曝光，使用Image J軟件對圖像進行灰度分析。

1.4.4 白細胞介素-1β(IL-1β)水平的檢測 取對照組與實驗組于感染后第3天、第7天小鼠，摘除眼球取血，將全血在室溫下放置1 h，待全血自然凝固并析出血清后，4 ℃環境下，1 000×g 離心20 min，收集血清。按照 ELISA 檢測試劑盒中說明書的步驟檢測小鼠血清 IL-1β含量。

2 結 果

2.1 兩組心肌組織NLRP3炎性小體及 Caspase-1 mRNA表達比較 RT-qPCR結果顯示，實驗組第3天、第7天處死小鼠的心肌組織中NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達較對照組明顯增加(P<0.05)。詳見圖1。

2.2 兩組心肌組織pro-Caspase-1及 Caspase-1蛋白水平比較 實驗組第3天、第7天處死小鼠的心肌組織pro-Caspase-1、Caspase-1的蛋白表達水平較對照組明顯增加(P<0.05)。詳見圖2～圖4。

與對照組比較，＊ P<0.05。圖1兩組心肌組織NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達比較

圖2 兩組心肌組織pro-Caspase-1及Caspase-1蛋白表達條帶圖

與對照組比較，＊ P<0.05。圖3兩組心肌組織pro-Caspase-1蛋白表達水平比較

與對照組比較，＊ P<0.05。圖4兩組心肌組織 Caspase-1蛋白表達水平比較

2.3 兩組小鼠血清IL-1β水平比較 實驗組第3天、第7天血清IL-1β水平較對照組明顯增加(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組小鼠血清IL-1β水平比較(±s) 單位：ng/L

3 討 論

近年來的研究發現，病毒性心肌炎的發病率和死亡率仍居高不下。CVB3感染是病毒性心肌炎的主要原因，可導致青壯年猝死或進展為擴張型心肌病。病毒性心肌炎的主要特征是局部和全身的炎癥反應。雖然炎癥過程最終是病毒消除和愈合的必要免疫防御，但炎癥是造成心肌損傷的主要機制[5]。

細胞焦亡是細胞發生的一種依賴Caspase、炎癥小體介導的程序性死亡，其特征是gasdermin D(GSDMD)介導的膜孔形成、細胞腫脹和快速裂解，隨后大量釋放促炎介質IL-1β、白細胞介素-18(IL-18)[6-7]。細胞焦亡不僅會引起局部炎癥，還會導致炎癥反應的放大。細胞焦亡主要有兩種途徑：Caspase-1介導的典型途徑和Caspase-4/Caspase-5/Caspase-11介導的非典型途徑[8]。其中細胞焦亡的經典途徑是由炎性小體激活來介導完成的。炎性小體的基本結構包括胞漿內模式識別受體(PRRs)、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC) 和 pro-Caspase-1(CASP1)3部分[9-10]。NLRP3是目前研究較為深入的炎性小體，可被病毒、細菌、真菌的 DNA 或 RNA、紫外線等外源性危險信號分子以及三磷酸腺苷(ATP)、晶體等內源性危險信號分子所激活[11-13]。NLRP3炎性小體被激活后，產生具有活性的Caspase-1，Caspase-1作用于細胞焦亡的執行蛋白GSDMD，從而產生GSDMD-N末端的活化形式；GSDMD-N端與細胞膜和細胞內細胞器膜上的脂質組分結合導致GSDMD-N低聚化。在質膜上形成非選擇性孔，使游離的細胞外水分進入細胞內，細胞迅速膨脹和破裂，推動細胞焦亡和釋放細胞內容物，導致炎癥反應[14]，同時GSDMD是炎癥介質IL-1β、IL-18分泌和成熟所必需的介質[15]，進一步擴大炎癥反應。目前公認的炎癥和細胞死亡在病毒性心肌炎、動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭中起重要作用[16]。越來越多的研究證實細胞焦亡與心血管疾病有關。

既往已有研究發現，NLRP3在CVB3所致心肌炎的發生發展中發揮重要作用，NLRP3及IL-1β mRNA的表達水平在CVB3感染的小鼠心臟中明顯升高[17]。病毒性心肌炎病人外周血NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達水平升高[18]。

本研究采用CVB3感染構建病毒性心肌炎小鼠模型，通過對發生細胞焦亡的過程中必要的信號分子進行檢測，發現實驗組第3天、第7天處死小鼠的心肌組織中NLRP3炎性小體及Caspase-1 mRNA表達較對照組明顯增加；心肌組織pro-Caspase-1、Caspase-1蛋白表達水平較對照組明顯增加；血清IL-1β表達較對照組明顯增加。NLRP3炎癥小體由 NLRP3、ASC 和 pro-Caspase-1 組成[4]。實驗組心肌組織中NLRP3炎性小體mRAN及pro-Caspase-1的蛋白表達水平明顯增加，提示細胞焦亡已被激活。Caspase-1作為細胞焦亡的主要介導者，通過對其在實驗組心肌組織中的mRNA及蛋白表達明顯升高，可以證明Caspase-1已被活化，同時活化后的Caspase-1可加工分泌促炎細胞因子IL-1β，從而放大局部炎癥反應，本研究中實驗組小鼠血清IL-1β明顯升高，進一步提示 NLRP3 炎癥小體-Caspase-1-IL-1β通路在CVB3誘導的病毒性心肌炎病理生理過程中被激活，從而表明CVB3可通過誘導心肌發生細胞焦亡促進心肌炎癥反應的進展。

綜上所述，通過對CVB3病毒性心肌炎小鼠心肌細胞焦亡的實驗研究發現，CVB3可以通過誘導心肌細胞焦亡，從而促進心肌炎的進展。為臨床上診斷及尋找拮抗心肌細胞焦亡的藥物來減輕心肌炎癥反應，預防心肌纖維化提供了新的思路及策略。