MALAT1對神經病理性疼痛大鼠STAT3信號通路的影響

姚 瑤，劉 艷，胡 飛

神經病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是復雜的慢性疼痛病癥，由感染、腫瘤、自身免疫等因素引起的外周或中樞神經系統損傷及功能障礙所導致，主要臨床表現為炎癥區域持續性的自發痛、痛覺過敏和痛覺超敏，常見于脊髓損傷、皰疹病毒感染、癌癥化療及糖尿病病人，嚴重影響病人生存質量[1-2]。目前，NP患病率為6.9%～10.0%，臨床藥物干預及物理治療均效果欠佳，是臨床較為難治的神經系統癥狀之一[3]。而NP的發生機制尚未明確，深入探討其機制將有助于尋求有效的臨床鎮痛方案。研究發現，炎癥反應在誘發NP的初級損傷、次級損傷過程中起重要作用，其調控成為NP治療領域的研究熱點[4]。信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是連接炎癥反應與癌癥的關鍵信號通路分子，參與多種炎癥性疾病的發生發展[5-6]。已有研究發現，STAT3通路在NP的炎癥反應調控中扮演重要角色[7]。肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是被證實與非小細胞肺癌有關的第一個長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，可強化STAT3信號通路，在多種炎癥性疾病中發揮重要調節作用[8-9]，但在NP中的作用機制尚缺乏研究。本研究探討MALAT1對NP大鼠及STAT3信號通路的影響，以期為NP臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，體質量210～250 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2018-0004。飼養條件：晝夜交替(周期為12 h)，自由飲水、進食，溫度為22～25 ℃，相對濕度為40%～70%。

1.1.2 主要試劑 MALAT1的慢病毒干擾載體由武漢益普生物科技有限公司構建；RNA提取試劑盒(貨號：WLA088b)購自沈陽萬類生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：F-430)購自北京美科美生物技術開發有限公司；MALAT1、STAT3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海信帆生物科技有限公司設計合成；大鼠白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)試劑盒、RIPA裂解液(貨號：SBJ-R0064、SBJ-R0040、SBJ-R0546、SBJ-0995)購自南京森貝伽生物科技有限公司；磷酸化STAT3(p-STAT3)、STAT3抗體、GAPDH抗體、羊抗兔免疫球蛋白G(貨號：ab76315、ab68153、ab181602、ab133470)購自美國Abcam公司。

1.1.3 主要儀器 2390型Electronic Von Fery觸覺測痛儀購自美國CST公司；Lightcycler 480 Ⅱ型熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀購自德國Roche公司；MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司；AlphaImager Mini型凝膠成像系統購自美國ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理 大鼠適應性喂養1周，進行鞘內置管手術，置管后觀察3 d，選取置管成功的大鼠40只，分為對照組、假手術組、NP組、陰性慢病毒組和MALAT1 shRNA組，每組8只。NP組、陰性慢病毒組和MALAT1 shRNA組大鼠建立NP模型[3]：使用1%戊巴比妥鈉對大鼠(按0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉，左大腿剪毛，乙醇消毒，切開皮膚，暴露出坐骨神經分支，用4-0絲線結扎脛神經和腓總神經(松緊適中，以不影響神經血液循環、大鼠左后肢微微抽搐為宜)，該過程注意避免損傷其他神經，傷口處撒青霉素粉末預防感染，依次縫合肌肉、皮膚；假手術組僅暴露坐骨神經，不進行結扎，其他手術操作同上；對照組不進行手術。術后MALAT1 shRNA組大鼠鞘內注射30 μL MALAT1慢病毒干擾載體pLenti-CMV-MALAT1-RFP-Puro(1×109U/mL)，陰性慢病毒組注射等量陰性慢病毒干擾載體，對照組、假手術組、NP組注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠行為學測定 于造模前1 d及造模后1 d、7 d、14 d分別采用Von-Frey纖維法、熱輻射法測定大鼠的機械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，以評價大鼠機械痛覺過敏和熱痛覺過敏。MWT測定：將大鼠放在透明玻璃籠中(底部為1 cm×1 cm的鐵絲網)，用不同力度值的Von-Frey纖維絲刺激大鼠左后足掌心，直至出現縮足、舔足等動作即為陽性，記錄力度為痛閾值，初始力度為2 g，出現陽性反應則降低力度繼續刺激，反之提升力度繼續刺激，重復5次，每次間隔5 min，至少出現3次抬足反應的痛閾值記為MWT。TWL測定：將大鼠放在透明玻璃籠中(底部為1 cm×1 cm的鐵絲網)，用熱痛刺激儀照射大鼠左后足掌心，記錄照射開始至大鼠縮足間的時間，即TWL，均重復測量3次，每次間隔5 min，取均值。

1.2.3 qRT-PCR法檢測大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達情況 造模后14 d，將大鼠斷頭處死，取脊髓組織，取部分于冰上勻漿，RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，使用qRT-PCR試劑盒配制反應體系，在熒光定量PCR儀上檢測MALAT1、STAT3 mRNA表達水平，以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法表示結果。MALAT1正向引物：5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，反向引物：5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；STAT3正向引物：5′-ATGAGTGTGGCCGTTGCA-3′，反向引物：5′-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3′；內參GAPDH正向引物：5′-CCAGGGCTGCCTTCTCTTGT-3′，反向引物：5′-GTGCCGTTGAACTTGCCGTG-3′。

1.2.4 ELISA法檢測大鼠脊髓組織中炎癥相關因子表達情況 取部分脊髓組織于冰上勻漿，于4 ℃下，20 000×g離心30 min，分離上清液，使用IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒檢測IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測大鼠脊髓組織中STAT3通路相關蛋白表達情況 向剩余的脊髓組織加含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上勻漿，提取總蛋白，BCA法定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，脫脂奶粉封閉1 h，依次加一抗(p-STAT3、STAT3抗體、GAPDH抗體，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加二抗(羊抗兔免疫球蛋白G，1∶1 500)室溫孵育1 h，化學發光法顯色，掃描圖像，分析目的蛋白灰度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學指標檢測 造模前1 d，各組大鼠MWT、TWL比較差異均無統計學意義(P>0.05)。造模后1 d、7 d、14 d，對照組與假手術組大鼠MWT、TWL比較差異均無統計學意義(P>0.05)；與假手術組比較，NP組MWT明顯降低(P<0.05)，TWL明顯縮短(P<0.05)；NP組MWT、TWL與陰性慢病毒組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠MWT明顯升高(P<0.05)，TWL明顯延長(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠MWT、TWL比較(±s)

2.2 各組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達情況 對照組與假手術組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組比較，NP組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；NP組與陰性慢病毒組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠脊髓組織中MALAT1、STAT3 mRNA表達水平比較(±s)

2.3 各組大鼠脊髓組織中炎癥相關因子表達情況 對照組與假手術組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組比較，NP組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平明顯升高(P<0.05)；NP組與陰性慢病毒組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平比較(±s) 單位：pg/mg

2.4 各組大鼠脊髓組織中STAT3通路相關蛋白表達情況 對照組與假手術組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組比較，NP組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；NP組與陰性慢病毒組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與陰性慢病毒組比較，MALAT1 shRNA組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 各組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3蛋白表達條帶圖

表4 各組大鼠脊髓組織中p-STAT3、STAT3蛋白表達水平比較(±s)

3 討 論

NP是臨床常見疾病，病因、癥狀多樣，發病機制復雜，臨床尚缺乏有效根治的方法，且無法在人體中進行模擬研究[10]。為進一步闡明NP的發病作用機制并尋找緩解NP的方法，本研究采用坐骨神經分支選擇性結扎法建立NP大鼠模型，造模后1 d，NP組大鼠較假手術組大鼠MWT明顯降低，TWL明顯縮短，即大鼠出現機械痛覺過敏及熱痛覺過敏，表明模型制備成功。

慢性神經性痛的發生發展是由多個因素相互影響的復雜過程，多重證據表明，炎癥通路中的炎癥介質可充當疼痛介質，參與NP的病理過程[11]。坐骨神經分支結扎損傷后引起局部組織炎癥反應，通過釋放內源性物質將外周感受器活化，進而將傷害性刺激傳入脊髓組織，導致脊髓組織釋放大量炎癥介質及致痛因子，參與NP的發生發展[12]。本研究結果亦顯示，與假手術組比較，NP組大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平明顯升高，提示炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β參與NP的發生過程。STAT3信號通路是細胞內信號轉導的主要媒介，可被多種細胞因子激活，在炎癥反應發生發展過程中發揮重要作用[13-14]。楊建梅等[15]研究顯示，復方藜芍片改善慢性偏頭痛的作用機制可能與阻斷大鼠皮層酪氨酸激酶2(JAK2)/STAT3通路，進而抑制神經炎癥有關。周瑞等[16]研究表明，鞘內注射MRS2211能明顯緩解糖尿病神經痛大鼠熱痛敏癥狀，其作用機制與抑制脊髓背角IL-1β、IL-6表達，進一步抑制JAK2/STAT3通路激活有關。本研究結果顯示，與假手術組比較，NP組大鼠脊髓組織中STAT3 mRNA水平及蛋白磷酸化水平均明顯升高，提示STAT3通路參與NP的病理進程。MALAT1屬于lncRNA，既往在癌癥方面多有研究，近年來發現其在多種炎癥相關疾病中發揮重要調節作用[8-9]。Wei等[17]研究發現，MALAT1可通過miR-150-5p /核轉錄因子-κB(NF-κB)軸調節敗血癥誘導的心臟炎癥。Patel等[18]研究表明，創傷性腦損傷后，脂肪干細胞衍生的外泌體中的MALAT1能調節炎癥反應，減輕腦皮質損傷。王悅等[19]研究發現，在大鼠肝損傷過程中，MALAT1的高表達與IL-6/STAT3信號通路激活有關。Wang等[20]研究發現，MALAT1能通過上調miR-20b-5p，進而增強STAT3，促進視網膜母細胞瘤發展。本研究顯示，與假手術組比較，NP組大鼠脊髓組織中MALAT1 mRNA表達水平明顯升高，提示MALAT1的異常升高與NP發生機制有關。本研究通過鞘內注射MALAT1慢病毒干擾載體下調MALAT1在大鼠中的表達，發現大鼠MWT明顯升高，TWL明顯延長，提示干擾MALAT1表達可緩解NP大鼠的機械痛覺過敏及熱痛覺過敏癥狀。同時，干擾MALAT1表達后，NP大鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-1β表達水平及STAT3 mRNA、蛋白磷酸化水平均明顯降低，提示干擾MALAT1表達可抑制NP大鼠脊髓組織炎癥反應并抑制STAT3信號通路激活。

綜上所述，MALAT1在NP大鼠體內高表達，干擾其表達能抑制NP大鼠體內炎癥反應及STAT3信號通路的激活，緩解機械痛覺過敏及熱痛覺過敏癥狀。