趨化素樣因子超家族成員1基因表達(dá)與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性及相關(guān)機(jī)制研究

齊貴彬,高建步,張明磊,張永杰,王 星,董曉雙

(河南大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 南陽473009)

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，相關(guān)研究認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是以單核細(xì)胞浸潤為主要特征的動(dòng)脈壁慢性炎性疾病[1]。單核細(xì)胞聚集是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其黏附于血管內(nèi)膜向主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞下間隙遷移，分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞[2]。近年來研究顯示，單核細(xì)胞聚集由趨化因子調(diào)控，其中趨化素樣因子超家族成員發(fā)揮重要作用[3]；趨化素樣因子超家族成員1(CKLFSF1)基因是該家族成員之一，目前關(guān)于其在冠心病發(fā)生中作用的研究仍十分少見。因此，本研究分析了CKLFSF1基因表達(dá)與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，并使用人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)和人單核細(xì)胞THP-1在體外進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，探討CKLFSF1基因參與冠心病發(fā)生與發(fā)展的相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

從2020年5月至2021年7月間在河南大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈造影檢查的患者中選取右冠脈、左前降支、左回旋支及主要分支中1支及以上直徑狹窄程度>50%的患者175例為冠心病組；未達(dá)到上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的非冠心病患者140例為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤，甲狀腺、肝、腎、血液系統(tǒng)疾病的患者；②合并感染性疾病、自身免疫學(xué)疾病的患者。入選患者均自愿參與本研究，簽署知情同意書。

1.2 材料與主要試劑

HAECs購于上海弘順生物有限公司；THP-1購于上海中喬新舟生物有限公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于美國SIGMA公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwells小室均購于南京訊貝生物有限公司；Trizol試劑盒購于上海通蔚生物有限公司；兔抗人血管細(xì)胞黏附因子(VCAM-1)單克隆抗體、兔抗人E-選擇素蛋白單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體以及相應(yīng)的二抗購于上海卓強(qiáng)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1臨床資料收集及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

收集患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、合并糖尿病、合并高血壓情況。空腹?fàn)顟B(tài)下采集患者空腹外周血5 ml，取其中3 ml室溫條件下3 000 r/min離心15 min，分離血清和血漿，分裝后-80℃保持待測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及血漿CKLFSF1蛋白表達(dá)水平。取另外的2 ml外周血，采用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，行定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 20 s，60℃ 45 s，95℃ 30 s，60℃ 20 s。取 RT-PCR產(chǎn)物5 μl，行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)CKLFSF1 mRNA表達(dá)水平。

1.3.2HAECs培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HAECs使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染使用的過表達(dá)CKLFSF1腺病毒和低表達(dá)CKLFSF1腺病毒均由北京諾賽基因組研究有限公司包被。將HAECs按密度1×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%時(shí)轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒，24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，高于90%。實(shí)驗(yàn)分為3組：正常HAECs組(常規(guī)培養(yǎng)，不做質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處理)；過表達(dá)CKLFSF1 HAECs組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)CKLFSF1腺病毒質(zhì)粒)；低表達(dá)CKLFSF1 HAECs組(轉(zhuǎn)染低表達(dá)CKLFSF1腺病毒質(zhì)粒)。

1.3.3THP-1培養(yǎng)

THP-1按1×105個(gè)/孔的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，其中加有含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放入37°C 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至15 ml離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，吹打混勻細(xì)胞懸液，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將3組HAECs分別計(jì)數(shù)5×104個(gè)接種于Transwells下室，加入DMEM培養(yǎng)液至600 μl，培養(yǎng)至HAECs完全貼壁后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將THP-1計(jì)數(shù)5×104個(gè)接種于Transwells上室，加入DMEM培養(yǎng)液至200 μl，培養(yǎng)12 h后取出上室，10%多聚甲醛溶液固定30 min，行姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.5細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

將3組HAECs分別按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液備用。將適量THP-1加入到15 ml離心管中，1 000 r/min離心10 min，加入3 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，以及濃度為10 mmol/L的鈣黃綠素，室溫下避光靜置30 min，洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按2×105個(gè)/孔將THP-1均勻鋪至已備好的含HAECs 6孔板中，室溫下避光靜置2 h，棄去培養(yǎng)液，洗滌后加入少量DMEM培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.6Western blot檢測(cè)各組HAECs中VCAM-1和E-選擇素蛋白表達(dá)水平

分別提取3組HAECs總蛋白，蛋白定量后電泳分離目標(biāo)蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜后封閉，滴加兔抗人血管細(xì)胞黏附因子(VCAM-1)單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人E-選擇素蛋白單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，1:2 000稀釋，室溫反應(yīng)2 h，E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析各條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，采用方差分析和t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，影響因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人口學(xué)特征和臨床指標(biāo)比較

冠心病組患者年齡、吸煙史比例、糖尿病比例、高血壓比例以及總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；男性比例、體質(zhì)量指數(shù)在兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組人口學(xué)特征和臨床指標(biāo)比較

2.2 兩組CKLFSF1 mRNA和血漿蛋白表達(dá)水平比較

冠心病組患者CKLFSF1 mRNA和血漿蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 兩組CKLFSF1 mRNA和血漿蛋白表達(dá)水平比較

2.3 冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析

見表3。以是否發(fā)生冠心病為因變量，年齡、吸煙史、糖尿病、高血壓以及總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析顯示，年齡、吸煙史、糖尿病、高血壓、CKLFSF1是冠心病發(fā)生的獨(dú)立影響因素。

表3 冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析

2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

Transwells細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)CKLFSF1 HAECs組中THP-1細(xì)胞遷移數(shù)量明顯高于正常HAECs組，低表達(dá)CKLFSF1 HAECs組中THP-1細(xì)胞遷移數(shù)量明顯低于正常HAECs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1，表4。

圖1 CKLFSF1基因表達(dá)變化對(duì)THP-1細(xì)胞遷移能力的影響(×100)

表4 各組THP-1細(xì)胞遷移數(shù)量比較個(gè)，n=12)

2.5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

過表達(dá)CKLFSF1 HAECs組中THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量明顯高于正常HAECs組，低表達(dá)CKLFSF1 HAECs組中THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量明顯低于正常HAECs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2，表5。

圖2 CKLFSF1基因表達(dá)變化對(duì)THP-1細(xì)胞黏附能力的影響(×400)

表5 各組THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量比較個(gè)，n=12)

2.6 各組HAECs中VCAM-1、E-選擇素蛋白表達(dá)水平比較

過表達(dá)CKLFSF1 HAECs組中VCAM-1、E-選擇素蛋白表達(dá)水平明顯高于正常HAECs組，低表達(dá)CKLFSF1 HAECs組中VCAM-1、E-選擇素蛋白表達(dá)水平明顯低于正常HAECs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3，表6。

圖3 各組HAECs中VCAM-1、E-選擇素蛋白表達(dá)的Western blot電泳圖

表6 各組HAECs中VCAM-1、E-選擇素蛋白表達(dá)量比較

3 討論

動(dòng)脈壁慢性炎癥反應(yīng)所致的動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎(chǔ)，早期特征包括血管內(nèi)皮損傷、單核細(xì)胞聚集至血管壁、血小板黏附[4]。研究者發(fā)現(xiàn)，冠心病的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果[5]；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，從基因?qū)用嫔详U述冠心病的發(fā)病機(jī)制已成為目前研究熱點(diǎn)之一。CKLFSF最早發(fā)現(xiàn)與腫瘤研究領(lǐng)域，作為抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程[6]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CKLFSF5基因rs723840位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病相關(guān)[7]；CKLFSF5基因與冠心病患者PCI術(shù)后血小板高反應(yīng)性和心血管不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)[8]。CKLFSF1基因?qū)儆贑KLFSF，但目前關(guān)于CKLFSF1基因表達(dá)與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系及可能機(jī)制仍鮮有研究報(bào)道。為此，本研究探討了CKLFSF1基因表達(dá)與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性及相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，年齡、吸煙史、糖尿病、高血壓、CKLFSF1是冠心病發(fā)生的獨(dú)立影響因素。隨著年齡的增加，身體機(jī)能出現(xiàn)退行性變化，冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提升，與中青年冠心病患者相比，老年患者由于合并癥較多，惡心、嘔吐、咳嗽等冠心病的臨床癥狀容易被隱匿，易錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)[9]。煙草中含有焦油、一氧化碳、尼古丁等多種有害成分，會(huì)刺激并損傷血管，引發(fā)冠心病。高血糖對(duì)人體多個(gè)器官的正常生理功能均存在不利影響，特別是對(duì)心臟、腎臟、腦的影響最大，糖尿病患者長期高血壓狀態(tài)會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成，導(dǎo)致冠心病[10]。相關(guān)研究顯示，高血壓患者中冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是血壓正常人群的4倍[11]。CKLFSF1基因mRNA和血漿蛋白表達(dá)水平是冠心病發(fā)生的獨(dú)立影響因素，提示CKLFSF1基因表達(dá)與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

進(jìn)一步分析CKLFSF1基因表達(dá)影響冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)機(jī)制，結(jié)果顯示，冠心病患者CKLFSF1 mRNA和血漿蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，且CKLFSF1基因過表達(dá)能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞向HAECs遷移、黏附，可推測(cè)CKLFSF1基因過表達(dá)能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。對(duì)CKLFSF1基因促進(jìn)THP-1細(xì)胞向HAECs遷移、黏附能力的相關(guān)機(jī)制研究顯示，過表達(dá)CKLFSF1 HAECs組VCAM-1、E-選擇素蛋白表達(dá)水平明顯高于正常HAECs組；低表達(dá)CKLFSF1 HAECs組VCAM-1、E-選擇素蛋白表達(dá)水平明顯低于正常HAECs組。VCAM-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，配體與VLA-4相互作用能夠促進(jìn)白細(xì)胞透過血管壁至炎癥部位，以及與T細(xì)胞、B細(xì)胞的相互作用[12]。E-選擇素存在于內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞活化后能夠合成并分布于細(xì)胞表面，分布于內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板表面的E-選擇素通過介導(dǎo)白細(xì)胞透過血管進(jìn)入炎癥區(qū)域組織以及另細(xì)胞再循環(huán)過程，參與凝血、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、多發(fā)性硬化等多種生理病理活動(dòng)[13]。本研究結(jié)果提示，CKLFSF1基因高表達(dá)能夠通過上調(diào)VCAM-1、E-選擇素表達(dá)來促進(jìn)人單核細(xì)胞遷移和黏附，誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病的發(fā)生與發(fā)展。本研究為CKLFSF1基因與冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性又增加了一項(xiàng)新的研究證據(jù)。