單寧酸沉淀淀粉行為的研究

劉子雋， 胡秀婷

(南昌大學食品學院，南昌 330047)

淀粉是天然可再生資源，是人類獲取能量的主要來源。由于淀粉來源豐富、價格低廉及其本身的特殊性質，被廣泛應用于生物醫藥、食品工業、化學工業等領域[1]。目前，淀粉的分離純化主要依賴于沉淀法，已報道的淀粉沉淀劑主要為甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，其中，乙醇因其可食用性被廣泛使用[2]。乙醇等有機溶劑沉淀淀粉的原理在于可以改變原淀粉溶液體系的極性，使淀粉在溶液中的溶解度降低，從而使沉淀析出[2]。但有機溶劑沉淀法具有沉淀效率低、成本高、安全性低(易燃易爆)等缺點。近年研究發現聚乙二醇也可作為淀粉的沉淀劑，其沉淀機理為聚乙二醇和淀粉在水溶液中具有不相容性[3,4]；雖然聚乙二醇作為固體沉淀劑其沉淀效率遠高于乙醇[4]，但固體沉淀劑聚乙二醇的分子量對沉淀效果具有顯著影響，然而聚乙二醇作為聚合物，分子量分布不均一，這導致操作重復性較差[5]。

單寧酸是一種存在于天然植物中的多酚類化合物[6]，可通過氫鍵或疏水作用與蛋白質分子反應使蛋白質沉淀，故可作為蛋白質的沉淀劑[7,8]。此外，也有研究表明單寧酸與多糖會發生類似于與蛋白質相同的反應過程，使多糖沉淀析出[9]，如單寧酸對魔芋葡聚糖具有顯著的親和力，可形成不溶性沉淀[10,11]；向小麥淀粉中添加單寧酸，也可使小麥淀粉從水溶液中沉淀析出[12]。

研究表明單寧酸可能作為淀粉的沉淀劑，然而，單寧酸沉淀淀粉的過程鮮有系統報道。因此，本研究以淀粉得率為指標，研究淀粉濃度、單寧酸添加量、環境溫度等因素對單寧酸沉淀淀粉過程的影響，并初步探究單寧酸沉淀淀粉的機理，為淀粉的分離純化工藝提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米淀粉(實驗室自制)；大米淀粉(市售)；單寧酸(分析純)；鹽酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；用0.2 mol/L的醋酸溶液和醋酸鈉溶液配制pH為4.0的緩沖液(現配現用)；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

LXJ-IIB低速離心機，FLOM超純水機，SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵，FiveEasy Plus pH計；Bede D1 HR X射線衍射儀，MicroCal PEAQ-ITC等溫滴定量熱儀。

1.3 方法

1.3.1 淀粉濃度、單寧酸添加量對淀粉沉淀過程的影響

配制淀粉溶液：稱取一定量的淀粉，溶于緩沖液中，在90 ℃下水浴糊化1 h，得到質量濃度為1.0%、2.0%、4.0%的淀粉溶液。

取糯米淀粉溶液與普通大米淀粉溶液，加入單寧酸粉末，使單寧酸與淀粉質量比分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0。在室溫下磁力攪拌1 h，使單寧酸在樣品溶液中溶解完全，靜置24 h后，將樣品溶液于離心機中在8 000 r/min下離心15 min，除去上清液，用無水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計算不同質量比下淀粉的得率。淀粉得率計算公式為：

式中：Y為淀粉沉淀得率/%；M為干燥后淀粉沉淀質量/g；m為淀粉溶液中淀粉干基質量/g。

1.3.2 沉淀時間對淀粉沉淀過程的影響

向質量濃度2.0%淀粉溶液中加入單寧酸，待單寧酸充分溶解后，將淀粉-單寧酸混合體系放置于室溫下靜置2、4、8、12、24 h。將靜置不同時間的樣品溶液于離心機中在8 000 r/min下離心15 min，并用無水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計算不同沉淀時間下的淀粉得率。

1.3.3 沉淀溫度對淀粉沉淀過程的影響

分別向質量濃度為2.0%的糯米淀粉溶液與普通大米淀粉溶液中加入單寧酸，待其充分溶解后，分別放置于25、4 ℃下靜置24 h后，將樣品溶液于離心機中在8 000 r/min下離心15 min，并用無水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計算不同溫度下的淀粉得率。

1.3.4 體系pH對淀粉沉淀過程的影響

向質量濃度為2.0%的淀粉溶液，通過添加NaOH溶液或HCl溶液調節體系中的pH，使其pH的范圍為3.0～11.0，然后加入單寧酸。最后將不同pH的樣品溶液放置室溫靜置24 h，將樣品溶液于離心機中在8 000 r/min下離心15 min，并用無水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計算不同pH條件下的淀粉得率。

1.3.5 金屬離子對淀粉沉淀過程的影響

向質量濃度為2.0%的淀粉溶液中加入0.20 mol/L氯化鋁、硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸鋅溶液后再加入單寧酸，充分攪拌使單寧酸溶解完全。將樣品溶液放置室溫靜置24 h后，將樣品溶液于離心機中在8 000 r/min下離心15 min，并用無水乙醇洗滌沉淀，于烘箱55 ℃干燥24 h后稱重，計算淀粉得率。

1.3.6 X射線衍射(XRD)分析

向2.0%的淀粉溶液中加入單寧酸，于室溫下靜止24 h后，置于離心機中在8 000 r/min下離心15 min后，將沉淀放于烘箱55 ℃干燥。取少量干燥后的復合物樣品充分研磨至粉末狀態，放入X射線衍射儀中進行檢測，得到XRD圖譜。測定條件為電壓40 kV，電流40 mA。衍射角(2θ)掃描范圍設為5°～50°，步長為每秒0.02°。利用Origin軟件進行分析。

1.3.7 等溫滴定量熱(ITC)分析

采用MicroCal PEAQ-ITC測定單寧酸與普通大米淀粉、糯米淀粉的相互作用。淀粉和單寧酸均使用醋酸緩沖溶液溶解。將10 g/L的單寧酸溶液每次3 μL分13次滴入200 μL的滴定池中，該滴定池裝有pH 4.0的緩沖液或0.4 g/L的淀粉溶液。每次滴入持續24 s，每次滴定間隔時間為180 s，實驗過程攪拌速度307 r/min。滴定池溶液的溫度設置為(25±0.1)℃。根據設置滴定時間，對每次滴加單寧酸時的吸熱或放熱的數據進行記錄。利用MicroCal PEAQ-ITC Analysis軟件計算單寧酸與淀粉相互作用的熱力學參數，建立“one set of sites”模式來擬合等溫線，該模型假設淀粉上的所有的綁定位點都是相同的。

2 結果與分析

2.1 淀粉濃度、單寧酸添加量對淀粉沉淀過程的影響

圖1是在淀粉質量濃度分別為1.0%、2.0%、4.0%時，向淀粉溶液中添加不同質量的單寧酸后，淀粉得率的變化。如圖1所示，單寧酸添加量對淀粉得率具有顯著的影響。以淀粉質量濃度為2.0%為例，在相同的單寧酸與淀粉質量比條件下，單寧酸對普通大米淀粉的沉淀效果優于糯米淀粉，這可能是因為普通大米淀粉中直鏈含量高于糯米淀粉。對于普通大米淀粉，隨著單寧酸與淀粉的質量比不斷增加，普通大米淀粉和糯米淀粉得率顯著增加，在質量比為0.6時，普通大米淀粉得率為92.0%，而當單寧酸與淀粉質量比到達0.6時，進一步添加單寧酸不會導致普通大米淀粉得率的顯著增加。因此，認為在單寧酸與普通大米淀粉質量比為0.6時，普通大米淀粉得率達到最大值。對于糯米淀粉，在質量比為0.8時，糯米淀粉得率為86.5%，而繼續增加單寧酸與淀粉的比例，發現沉淀得率無顯著性增加。因此，認為當單寧酸與糯米淀粉質量比為0.8時，單寧酸對糯米淀粉的沉淀效果最好。而在乙醇沉淀2.0%淀粉溶液的過程中發現，當在乙醇與淀粉溶液體積為5∶1時，淀粉得率達到最大值，為79.9%[13]。由此可見，單寧酸對淀粉的沉淀效率遠高于乙醇。

圖1 單寧酸沉淀普通大米淀粉和糯米淀粉過程

此外，在單寧酸與淀粉質量比為0.1～0.2的范圍內，沉淀得率都處于較低水平，這可能是因為在該范圍內，淀粉與單寧酸主要形成的是可溶性復合物，而隨著單寧酸與淀粉的質量比的進一步增加，復合物開始聚集，并逐漸形成不溶性復合物沉淀。當改變淀粉的質量濃度，沉淀淀粉所需的單寧酸量亦有顯著性變化，這表明沉淀淀粉所需的單寧酸量對淀粉的質量濃度具有依賴性。

2.2 沉淀時間對淀粉沉淀過程的影響

由圖2可知，隨著沉淀時間的增加，普通大米淀粉與糯米淀粉沉淀得率逐漸增加，即當沉淀時間由2～6 h時，2種淀粉得率均迅速上升，并在6 h基本達到最大值；而繼續延長沉淀時間，淀粉得率沒有顯著增加。因此，單寧酸沉淀淀粉最佳時間為6 h。與文獻報道中乙醇沉淀長時間(靜置過夜或24 h)相比[14]，單寧酸沉淀淀粉效率更高。

圖2 沉淀時間對淀粉得率的影響

2.3 沉淀溫度對淀粉沉淀過程的影響

如圖3所示，在相同溫度下，普通大米淀粉的沉淀得率均高于糯米淀粉，這可能是由于普通大米淀粉與糯米淀粉中的支鏈淀粉與直鏈淀粉含量不同，導致2種淀粉與單寧酸結合的程度不同。當沉淀溫度由4 ℃升至25 ℃，兩種淀粉溶液體系中的淀粉沉淀得率無顯著性差異，說明在單寧酸沉淀淀粉過程中，溫度變化并不是影響淀粉沉淀的主要因素。但考慮能源消耗的因素，選擇25 ℃為沉淀淀粉的最佳溫度。與醇沉淀粉的過程大多都在低溫下進行相比，單寧酸沉淀淀粉過程能量消耗更少。有研究在4 ℃和37 ℃下使用聚乙二醇沉淀淀粉時發現，聚乙二醇對溫度變化也不敏感，沉淀得率沒有顯著性差異[15]。這與本實驗結果一致，推測這可能是固體沉淀劑的特有性質。

圖3 不同溫度(4、25 ℃)對淀粉得率的影響

2.4 體系pH對淀粉沉淀過程的影響

如圖4所示，pH對普通大米淀粉、糯米淀粉的得率具有顯著影響，且得率都隨著pH的升高而降低。在pH 3.0～5.0條件下，淀粉得率較大，而在pH 6.0～11.0條件下，得率相比酸性條件降低。導致這些現象的原因可能是：隨pH的變化，單寧酸酚羥基的電離程度發生了改變使得沉淀過程也發生變化。研究報道發現，單寧酸質子化程度會影響單寧酸與其他生物分子相互作用的方式和強度[16]。單寧酸的pKa值范圍在7.5～13.5之間，在pH 3.0～5.0條件下，單寧酸上的羥基幾乎完全被質子化，使得淀粉與單寧酸之間的相互作用加強，從而使得淀粉得率增加。

圖4 pH對淀粉得率的影響

2.5 金屬離子對淀粉沉淀過程的影響

單寧酸可通過其結構單元上的酚羥基與金屬離子進行配位，發生絡合反應，從而對單寧酸沉淀蛋白質的過程產生影響[17]。因此，本文亦研究了金屬離子的添加對單寧酸沉淀淀粉影響。從圖5中可以發現，加入金屬離子后，普通大米淀粉和糯米淀粉的得率沒有顯著差異，這表明金屬離子的存在對單寧酸沉淀淀粉無影響。這可能是由于單寧酸與金屬離子之間的配位鍵作用并不影響單寧酸與淀粉的相互作用。

圖5 金屬離子對淀粉得率的影響

2.6 單寧酸-淀粉復合物X射線衍射分析

不同類型的淀粉具有不同的晶型，在X射線衍射圖譜中的衍射峰不同。根據其晶型主要分為四類：A型、B型、C型以及V型。A型、B型、C型圖譜在天然淀粉中比較常見，V型淀粉是一種特殊的晶型，一般是由糊化后的淀粉與小分子客體分子絡合形成，主要在7°、13°、20°出現衍射峰[18]。圖6為糊化后的淀粉、單寧酸、單寧酸沉淀的大米淀粉和糯米淀粉的X射線衍射圖譜。糊化后的淀粉的特征峰消失，出現了非晶特性；單寧酸處于無定形狀態；單寧酸沉淀的普通大米淀粉與糯米淀粉在7°、13°、20°處均未出現衍射峰，表明單寧酸未與淀粉形成V型復合物。多酚分子可通過疏水作用進入淀粉的空腔內進行特異性結合從而形成V型復合物[18]。而淀粉與單寧酸未形成V型復合物，這表明單寧酸與淀粉可能不存在疏水相互作用。

注：a為糊化后的淀粉；b為單寧酸沉淀的糯米淀粉；c為單寧酸；d為單寧酸沉淀的普通大米淀粉。圖6 X射線衍射圖譜

2.7 等溫滴定量熱分析

ITC是表征分子相互作用的最有效的方法之一，可用于研究多酚與蛋白質、多糖等的相互作用，它的優點是能夠靈敏的測量配體和聚合物相互作用的焓變化，并提供重要的數據，如結合常數、結合位點、吉布斯自由能、焓值、熵值等。放熱或吸熱是分子間相互作用的普遍特性，在共價鍵的形成和非共價鍵的重組和形成中均可觀察到。ITC的基本原理是將配體逐漸滴入大分子(受體)中，同時參比池和樣品池的溫度保持不變，若在滴定過程中發生相互作用，則會釋放或吸收熱量，每次滴入后峰面積即為滴定所產生的熱量[19,20]。隨著反應逐漸完全，受體的結合位點都被占據，峰的高度可能不再變化。本實驗中，ITC記錄了單寧酸滴入緩沖液(pH 4.0)、普通大米淀粉溶液及糯米淀粉溶液的熱流變化。如圖7a所示，單寧酸滴入醋酸緩沖溶液中形成了小型的吸熱峰，這說明單寧酸的稀釋過程是一個吸熱反應。而當單寧酸滴入淀粉溶液后，發現該過程焓值變化小于零，該現象說明單寧酸滴入淀粉溶液的過程是一個放熱反應；并且放出的熱量隨著滴入單寧酸的比例增加而減少，這說明淀粉與單寧酸的結合位點在逐漸減少。

普通大米淀粉、糯米淀粉與單寧酸的熱量-質量比曲線如圖7b、圖7c所示，通過對曲線的擬合得到普通大米淀粉、糯米淀粉與單寧酸相互作用的熱力學參數。單寧酸與普通大米淀粉結合的化學計量數(N)為(0.64±0.12)，這表明在單寧酸與普通大米淀粉的質量比約為0.64時，普通大米淀粉上的結合位點基本達到飽和，在質量比為0.6處淀粉得率最高；單寧酸與糯米淀粉結合的化學計量數(N)為(0.89±0.16)，說明糯米淀粉分子上的結合位點在兩者質量比約為0.89時達到了飽和，與2.1的結果一致，糯米淀粉得率在二者質量比為0.8時最高。普通大米淀粉與單寧酸的結合常數(K)為(357±116)，糯米淀粉與單寧酸的結合常數(K)為(438±172)，結合常數都處于較小水平，這表明兩者之間的親和力較弱。

圖7 單寧酸在25 ℃下的等溫滴定量熱分析曲線

此外，計算發現：普通大米淀粉與單寧酸反應過程中焓值(ΔH)為(-2.04±0.06)cal/g，熵值(ΔS)為1.12 × 10-3cal/(g·K)，吉布斯自由能(ΔG)為-4.13 cal/g；糯米淀粉與單寧酸反應過程中焓值(ΔH)為(-0.98±0.03)cal/g，熵值(ΔS)為0.99 ×10-3cal/(g·K)，吉布斯自由能(ΔG)為-1.28 cal/g。根據Ross的研究，認為混合體系內主要存在兩種結合反應：一種是熵驅動反應，即ΔH>0(吸熱反應)，ΔS>0(熵增)，TΔS>ΔH，體系中主要是熵效應導致該混合體系內ΔG<0，該反應屬于熵驅動，主要驅動力為分子間的疏水作用；另一種反應是以焓驅動為主要推動的焓-熵補償反應，即ΔH<0(放熱反應)，ΔS>0(熵增)，|TΔS|<|ΔH|，體系中熵效應與放熱共同導致體系的ΔG<0，該反應的主要驅動力為氫鍵或靜電相互作用[21]。由此可見，單寧酸與淀粉之間的相互作用屬于以焓驅動為主的焓-熵補償的過程，而淀粉屬于中性物質。因此，單寧酸與淀粉之間的相互作用力是以氫鍵為主的非共價相互作用力，且該反應是自發進行的。當多酚與淀粉形成非包合物時，主要通過形成氫鍵進行相互作用[22-25]，這與本實驗結果一致。如Chai等[25]通過XRD發現淀粉分子與茶多酚之間也未形成V型復合物，推測茶多酚可能是以氫鍵為橋梁與淀粉分子作用 。因此，推測單寧酸沉淀淀粉的機理為：單寧酸與水分子競爭淀粉，并與淀粉分子形成穩定的氫鍵，從而使淀粉沉淀析出。

3 結論

單寧酸的添加量、沉淀時間、體系pH等因素對單寧酸沉淀淀粉過程有顯著性影響；而沉淀溫度和金屬離子對淀粉沉淀過程無顯著影響。淀粉濃度越高，沉淀淀粉所需單寧酸的添加量越大；pH越低，單寧酸沉淀淀粉效率越高；綜合實驗結果和成本，單寧酸沉淀淀粉的最佳溫度為25 ℃，最佳時間為6 h。XRD與ITC分析表明單寧酸可能與水分子競爭淀粉分子形成氫鍵，從而導致淀粉從水溶液中沉淀析出。