響應(yīng)面優(yōu)化竹葉黃酮酶法酯化及抗氧化評(píng)價(jià)

羅洪杰， 史波波， 王思懿， 祝佩瑤， 許 江， 錢俊青

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310000)

竹葉黃酮是我國盛產(chǎn)的天然酚類化合物，具有多種生物活性，在抗菌、清除自由基、抗突變、清熱解毒、調(diào)節(jié)血脂等方面均具有效果，抗氧化性較強(qiáng)[1-3]，是國家批準(zhǔn)使用的食品抗氧化劑。目前，對(duì)竹葉黃酮的生理功能及抗氧化性能已開展了較為深入的研究[4]，黃酮含量較高的產(chǎn)品生理功能較強(qiáng)，特別是抗氧化性能有較大提升[5]。黃酮類化合物的自由基清除和抗氧化能力強(qiáng)弱取決于黃酮的類型和結(jié)構(gòu)[6]。張英等[7]研究了12種黃酮單體清除自由基的能力，結(jié)果表明，12種黃酮均有清除自由基的能力，7種竹葉黃酮除含量較低的甲氧基牡荊苷外，其余6種清除和抑制活性氧自由基的能力超過或相當(dāng)于槲皮素，表明竹葉黃酮的抗氧化活性超過銀杏葉黃酮。

楊國棟等[8]通過鄰苯三酚自氧化體系、鄰二氮菲—Fe2+體系、自由基(DPPH)體系以及 H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血體系對(duì)竹葉黃酮單體葒草苷和牡荊苷抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明葒草苷能夠清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基，保護(hù)紅細(xì)胞，一定濃度范圍內(nèi)呈良好的量效關(guān)系。牡荊苷也具有抗氧化活性，但清除自由基能力較葒草苷弱。Shibano等[9]采用DPPH清除自由基方法測試了12種黃酮單體的抗氧化能力，其中竹葉黃酮單體異葒草苷，葒草苷清除自由基的EC50為6.2～6.7 μg/mL，抗氧化能力較為突出。

竹葉黃酮抗氧化性能優(yōu)異，作為食品抗氧化劑非常理想。但竹葉黃酮以糖苷的形式存在，多羥基及糖基結(jié)構(gòu)，具較好的親水性，油溶性較差[3]，因此，應(yīng)用于油脂中進(jìn)行抗氧化比較困難。我國是植物油消費(fèi)大國，植物油所含的不飽和脂肪酸在儲(chǔ)運(yùn)中易氧化，嚴(yán)重影響油脂品質(zhì)與食用安全性。目前商品植物油的抗氧化基本采用化學(xué)抗氧化劑，安全性不及天然抗氧化劑高，因此解決竹葉黃酮應(yīng)用于植物油抗氧化的困難十分必要。同時(shí)竹葉黃酮產(chǎn)品的穩(wěn)定性不夠高，在儲(chǔ)存中易氧化變質(zhì)，也是需解決的重要問題。

植物黃酮可與脂肪酸或芳香酸在脂肪酶催化下直接發(fā)生酯化反應(yīng)[10,11]。黃酮酯化后，不僅能提高其在油脂中的溶解性，也可增加儲(chǔ)存穩(wěn)定性[12]，作為植物油抗氧化劑應(yīng)用十分有利。酶催化反應(yīng)條件溫和，可保持植物黃酮的分子結(jié)構(gòu)不變，不影響其抗氧化等生物活性[13,14]，因此，開展酶催化竹葉黃酮酯化研究，可克服竹葉黃酮油溶性差的缺陷，有助于提高竹葉黃酮的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。我國竹葉黃酮資源豐富，酶法酯化竹葉黃酮的研究開發(fā)具有理想的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)以棕櫚油為酰基供體，研究了竹葉黃酮與棕櫚油的酶催化酯交換工藝。以曲面響應(yīng)法優(yōu)化酯化工藝條件，并采用石油醚和乙醇水溶液分別萃取回收未反應(yīng)的棕櫚油和竹葉黃酮，采用鄰二氮菲Fe2+氧化法評(píng)價(jià)了竹葉黃酮酯的抗氧化活性，可為竹葉黃酮在油脂中的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹葉黃酮(總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)43.0%)，Novozym?435脂肪酶，異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品，葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品，牡荊苷，異牡荊苷，葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%)；維生素C、維生素E、棕櫚油、叔戊醇等試劑均為分析純；分子篩的有效孔徑為0.4 nm。

Agilent 1200 series高效液相色譜儀，752型紫外可見光度計(jì)，ULUP-I-微量分析型超純水機(jī)，R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 黃酮酶催化酯化方法

以竹葉黃酮(總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)43.0%)和棕櫚油為反應(yīng)底物，在50 mL錐形瓶中加入竹葉黃酮、棕櫚油、脂肪酶，及經(jīng)300 ℃活化6 h的0.4 nm分子篩，以干燥的叔戊醇為反應(yīng)溶劑，在水浴中保溫振蕩反應(yīng)，黃酮的酯化率作為指標(biāo)，考察脂肪酶的種類、酶的用量、底物濃度比、酯化溫度與時(shí)間、溶劑用量和分子篩的用量。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定的酯化條件為：底物為0.45 g竹葉黃酮(43.0%)、2.0 g棕櫚油、0.2 g Novozym 435脂肪酶，2 g 0.4 nm分子篩，反應(yīng)溶劑叔戊醇15 mL，在60 ℃、210 r/min條件下振蕩反應(yīng)72 h，酯化率達(dá)30.0%。在此基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面法優(yōu)化酯化工藝。

1.3 黃酮酯的純化方法

竹葉黃酮與棕櫚油酯化反應(yīng)完成后，回收未反應(yīng)的黃酮及棕櫚油，純化竹葉黃酮酯。參考文獻(xiàn)方法[15]，在酯化反應(yīng)完成后將反應(yīng)液真空旋轉(zhuǎn)蒸餾，回收叔戊醇，固形物加入石油醚，萃取未反應(yīng)的棕櫚油，然后將萃取液離心分離，上清液真空旋蒸至干，稱重，以石油醚萃取的棕櫚油量計(jì)算除油率，通過液相色譜法檢測計(jì)算竹葉黃酮酯的回收率，以除油率和回收率綜合考察除油工藝。

將上一步離心得到的固形物采用95%乙醇溶解，離心去除沉淀，上清液真空蒸餾回收95%乙醇，固形物用乙醇水溶液萃取回收竹葉黃酮，萃取的油狀物為竹葉黃酮酯。通過液相色譜法檢測萃取純化的竹葉黃酮酯純度，并計(jì)算純化的回收率，以黃酮酯的純度和回收率考察萃取純化工藝。

1.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)[16,17]，選擇檢測比較穩(wěn)定的鄰二氮菲Fe2+氧化法開展純化的竹葉黃酮酯抗氧化性能評(píng)價(jià)。取0.2 mL 5×10-3mol/L鄰二氮菲和1 mL 50×10-3mol/ L Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)于5 mL具塞比色管中，加入0.2 mL 7.5×10-3mol/L FeSO4溶液，立即搖勻后，加入200 μL質(zhì)量濃度相同的樣品溶液，然后再加入0.2 mL l %的H2O2溶液，乙醇定容。充分搖勻后，37 ℃水浴中保溫60 min，測定溶液在536 nm處的吸光度值。其清除率按公式計(jì)算：

清除率=[(A2-A3)/(A1-A3)]×100%

式中：A1為不加H2O2和樣品時(shí)的吸光度；A2為加入H2O2和樣品時(shí)的吸光度；A3為加入H2O2，但不加樣品時(shí)的吸光度。

1.5 竹葉黃酮與黃酮酯液相色譜檢測方法及黃酮酯色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法

采用C18反相色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相：A(乙腈)和B(0.3%乙酸水)，梯度洗脫條件為0 min(10∶90)，25 min(100∶0)和35 min(10∶90)，進(jìn)樣量為20 μL，流速為0.7 mL/min，檢測波長為330 nm[16]。以竹葉黃酮單體的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照定性，混合黃酮酯的面積歸一法進(jìn)行純度定量，混合黃酮酯總面積比較計(jì)算純化工藝回收率。

黃酮酯HPLC色譜分離洗脫, 產(chǎn)物經(jīng)陽離子源(ESI) 通過飛行時(shí)間質(zhì)譜 (Agilent 6210 TOFMS，America)，電離模式采取陰離子模式，氮?dú)饬魉?L/min, 30 psi 噴霧器壓力，溫度300 ℃，全掃描m/z50～1 500之間。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹葉黃酮原料及反應(yīng)產(chǎn)物的檢測

如圖1所示，經(jīng)6種竹葉黃酮組分單體的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比對(duì)，其中含量較高的組分2和組分3分別為異葒草苷和葒草苷，組分1為葒草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷，保留時(shí)間20 min的組分為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷。在保留時(shí)間30～33 min的含量較高的組分為牡荊苷及異牡荊苷，而保留時(shí)間45～55 min的峰是竹葉黃酮產(chǎn)品共存的其他竹葉成分，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的竹葉黃酮組分一致。色譜檢測表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.0%的竹葉黃酮中6種組分齊全，對(duì)照文獻(xiàn)[4,5]，各組分含量比例適宜，適合作為酶催化酯化研究的原料，可合理評(píng)價(jià)酯化得到的黃酮酯的抗氧化性能。

圖1 竹葉黃酮的液相色譜圖

酯化反應(yīng)產(chǎn)物液相色譜檢測結(jié)果如圖2所示。保留時(shí)間為20～30 min的峰為竹葉黃酮酯混合產(chǎn)物。對(duì)其中含量最高的異葒草苷棕櫚酸酯進(jìn)行液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用檢測，結(jié)果如圖3所示。質(zhì)譜圖體現(xiàn)的分子質(zhì)量符合異葒草苷棕櫚酸酯的分子質(zhì)量。圖3表明，以棕櫚油為酰基供體，脂肪酶催化竹葉黃酮可順利進(jìn)行酯化反應(yīng)。

圖2 竹葉黃酮和棕櫚油的酶催化酯化產(chǎn)物色譜圖

圖3 異葒草苷棕櫚酸酯的HPLC-MS分析圖

2.2 黃酮酯化工藝響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 單因素的方差分析

酯化工藝單因素確定后，通過F檢驗(yàn)法對(duì)各單因素進(jìn)行方差分析，評(píng)價(jià)其顯著性。計(jì)算結(jié)果見表1，其中F>F臨界值，P<0.001，則表示該因素對(duì)工藝有顯著影響。除反應(yīng)時(shí)間和溶劑用量外，其他因素均對(duì)黃酮酯化率有顯著的影響。

表1 酯化工藝單因素的方差分析

2.2.2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果處理

在工藝單因素方差分析的基礎(chǔ)上，考慮到酶的種類并不是本次實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)，故選顯著性較強(qiáng)的其他4個(gè)因素作為PB設(shè)計(jì)的研究因素[19]，每個(gè)因素取兩水平：高水平(+)和低水平(-)，以酯化率為考察指標(biāo)。選取的各因素的水平如表2，M=4的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。應(yīng)用Design-Expert(8.01)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算結(jié)果見表4，P-value<0.01為顯著的因素，從表4中可以看出，棕櫚油的使用量為最顯著的因素，溫度和加酶量為較顯著的因素，與文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮酶催化酯化影響因素相似[20,21]，因此以這3個(gè)因素作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的單因素。

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的水平

表3 PB實(shí)驗(yàn)(M=4)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 ANOVA分析因素模型

2.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以酯化率為響應(yīng)值，篩選得到溫度、酶添加量，棕櫚油添加量3個(gè)因素，每個(gè)因素取兩水平：高水平(+)和低水平(-)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件處理，采用一次型進(jìn)行變異分析(Analysis of value，ANOVA)，其方差分析的結(jié)果見表6，對(duì)各因素與響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合，得出模型對(duì)應(yīng)的回歸方程為：

酯化率=0.403 50A+44.050 00B+4.360 00C-10.547 21

表6 回歸模型方差分析

由表6可以看出，以酯化率為響應(yīng)值時(shí)，模型P=0.000 7<0.01，表明回歸方差模型極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.880 7>0.05，不顯著。所以該模型的擬合度較高，說明實(shí)驗(yàn)所得方程能較好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。此外該模型的決定系數(shù)R2=0.718 5，表明預(yù)測值與真實(shí)值有較高的相關(guān)性。根據(jù)文獻(xiàn)[22]，相對(duì)較低的變異率(CV=3.2 %)說明實(shí)驗(yàn)的可操作性較好。因此，該模型可較好地分析和預(yù)測各因素變化時(shí)酯化率的真實(shí)情況。

若采用二次型進(jìn)行變異分析，模型P=0.054 9>0.05，不顯著，表明二次型不適用于本實(shí)驗(yàn)的變異分析。考察各因素之間交互作用的響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果表明溫度與酶添加量(AB)、溫度與棕櫚油添加量(AC)、酶添加量與棕櫚油添加量(BC)之間的交互作用均不明顯，與方差分析結(jié)果相符。

根據(jù)回歸模型，求得最佳的單因素條件為：A=60，B=0.25，C=2.0。即：反應(yīng)溫度60 ℃，脂肪酶的用量為0.25 g，棕櫚油的用量為2.0 g，酯化率的預(yù)測值為33.39%。為了驗(yàn)證模型方程的有效性，進(jìn)行了優(yōu)化條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次的平均酯化率為(33.13±2.0)%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值吻合情況較好。可見該模型可以用于竹葉黃酮的酶法酯化優(yōu)化，證明該模型是合適的，有指導(dǎo)意義。與文獻(xiàn)[23,24]報(bào)道的植物黃酮酶催化酯化工藝比較，具有較好的酯化效果。

2.3 竹葉黃酮酯的純化

2.3.1 萃取棕櫚油工藝石油醚用量考察

酯化反應(yīng)結(jié)束后，以產(chǎn)物的質(zhì)量和石油醚體積的比作為因素考查了萃取除油回收棕櫚油工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。隨著石油醚體積的增大，除油率逐漸下降，但回收率則逐漸回升，當(dāng)產(chǎn)物的質(zhì)量和石油醚體積的比為12∶100時(shí)，除油率為95.5%，黃酮酯回收率為88.9%。2個(gè)指標(biāo)均比較理想，故選取12∶100作為黃酮酯石油醚萃取除油的條件。

圖4 石油醚的用量對(duì)除油率和黃酮酯回收率的影響

2.3.2 萃取竹葉黃酮的乙醇水溶液濃度確定

除油工藝確定后，考察了不同濃度的乙醇水溶液萃取回收殘留竹葉黃酮的效果，除油的黃酮酯化產(chǎn)品質(zhì)量70 mg，乙醇水溶液體積為10 mL，萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。隨著乙醇濃度的增加，產(chǎn)品的純度不斷提高，但回收率則逐漸下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30.0%時(shí)，黃酮酯的純度達(dá)到84.4%，回收率達(dá)到82.1%。兩個(gè)指標(biāo)較理想，故以此乙醇水溶液濃度確定為萃取竹葉黃酮的條件。

圖5 乙醇濃度對(duì)產(chǎn)品純度和回收率的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，竹葉黃酮酯純化方法確定為：酯化反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)品真空旋干，回收叔戊醇，7.7 g產(chǎn)物加入石油醚100 mL，50 ℃溫度下210 r/min振蕩30 min，萃取未反應(yīng)的棕櫚油，以5 000 r/min離心分離，上清液為石油醚棕櫚油層，固形物為竹葉黃酮與黃酮酯混合物，除油率為95.5%，黃酮酯回收率為88.9%。

將上一步得到的固形物用95%乙醇溶解，離心去除沉淀(包括酶和分子篩)，95%乙醇真空旋蒸回收后，按1 g固形物用30.0%的乙醇溶液150 mL的比例加入乙醇溶液，在50 ℃，210 r/min條件下振蕩30 min后，分離上清液，而固形物即為黃酮酯。得到的竹葉黃酮酯經(jīng)檢測純度達(dá)到84.4%，回收率為82.1%，純化產(chǎn)品作為抗氧化評(píng)價(jià)樣品。

2.4 竹葉黃酮酯抗氧化評(píng)價(jià)

對(duì)竹葉黃酮(AOB)，竹葉黃酮棕櫚酸酯(AOB-PALM)與維生素C(VC)和維生素E(VE)進(jìn)行抗氧化性能評(píng)價(jià)。以鄰二氮菲Fe2+氧化法測定了四種抗氧化劑的自由基清除能力，半數(shù)清除率(IC50)表示抗氧化能力的強(qiáng)弱，結(jié)果如圖6所示。竹葉黃酮酯產(chǎn)物比竹葉黃酮的自由基清除率有所下降，但仍具有較強(qiáng)的抗氧化活性，IC50介于維生素C和維生素E之間，與報(bào)道的竹葉黃酮抗氧化研究文獻(xiàn)比較[25,26]，抗氧化評(píng)價(jià)結(jié)果類似，表明竹葉黃酮酯化產(chǎn)品的抗氧化性能保持良好。

圖6 VC，VE，竹葉黃酮及黃酮棕櫚酸酯的半數(shù)清除率IC50值

3 結(jié)論

以棕櫚油為酰基供體，脂肪酶催化竹葉黃酮酯化，通過單因素考察和響應(yīng)面優(yōu)化，確定酯化的工藝條件為總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.0%的竹葉黃酮0.45 g、棕櫚油2.0 g，Novozym?435脂肪酶0.25 g，0.4 nm分子篩2 g，加入15 mL干燥的叔戊醇于50 mL錐形瓶中，在60 ℃，210 r/min條件下振蕩反應(yīng)時(shí)間72 h，酯化率達(dá)(33.1±2.0)%。

竹葉黃酮酯化反應(yīng)完成后，分別采用石油醚和30.0 %的乙醇水溶液萃取回收未反應(yīng)的棕櫚油和竹葉黃酮，純化得到的竹葉黃酮酯純度達(dá)84.4%，回收率為82.1%。

酶催化棕櫚油為酰基供體酯化竹葉黃酮，可有效提高竹葉黃酮的脂溶性，較好保留了竹葉黃酮的抗氧化活性，可作為食品抗氧化劑在植物油中應(yīng)用。