正交試驗設計優化黃芪甲苷提取工藝研究

童 丹

（甘肅中醫藥大學，蘭州 730000）

黃芪是經典的多效中藥[1]，藥用歷史久遠，除用于治療人體疾病之外，還大量用于獸醫臨床中。如黃芪、淫羊藿、 紅花合劑能有效提升公雞的腔上囊重量，促進腔上囊發育。 黃芪作為抗病毒藥物，常用于治療動物病毒性感冒，可提高動物機體的免疫力。 黃芪作為補氣藥材，可提高細胞質及血液中皮質酮濃度，減弱動物機體對各種不良應激的敏感性，減少各種應激性綜合征發生率，從而有效降低病死率。 黃芪已被列入國家衛健委117 種“藥食同源”植物，并作為飼料添加劑被廣泛應用。黃芪及黃芪提取物作為新型中草藥飼料添加劑，可促進動物生長、增強動物機體免疫力、提高機體抵抗力、降低料肉比、提高動物產品品質和產量。 黃芪甲苷作為黃芪的主要藥理活性成分之一，具有調節免疫抗氧化、抗菌消炎、抗應激及促生長等作用[2]，還能提高機體新陳代謝、調節腸道微生態、抗病毒和增強機體免疫力等多種藥理活性[3]。 《中國藥典》（2015 年版）規定黃芪甲苷含量是黃芪質量控制的主要指標。以黃芪甲苷提取量為衡量指標，采用醇提法，通過四因素三水平正交試驗設計，優化黃芪甲苷提取工藝[4][5-7]，確定黃芪甲苷最佳提取工藝參數，為黃芪甲苷提取及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪藥材產自甘肅中醫藥大學定西校區藥材種植試驗園。

1.2 試劑

黃芪甲苷標準品，購自上海源葉生物科技有限公司，批號CJ0101QA14。 其余試劑均為分析純。

1.3 儀器設備

UV-2600 紫外-可見分光光度計： 日本島津公司；Million-QB 超純水機：Million 公司；CXP-100 高速多功能粉碎機： 上海市晟喜制藥機械有限公司；SB-5200DT 超聲波清洗機： 寧波新芝生物科技股份有限公司；數HH-4 型顯恒溫水浴鍋：上海高興儀器設備有限公司；BT224S 電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）；DZF-6050-T 智能真空干燥箱： 上海丙林電子科技有限公司；DZF-6090 真空冷凍干燥器： 上海中友儀器設備有限公司；TGL-20B-C 離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 黃芪甲苷供試液制備黃芪洗干凈，曬干，切段，粉碎，再用孔徑40 目的篩子過篩，通風干燥保存備用。準確稱量已處理好的黃芪粉末4.0 g， 用一定濃度的乙醇溶液作為提取溶劑，在數顯恒溫水浴鍋中回流提取，趁熱過濾，收集濾液，用旋轉蒸發儀將乙醇蒸出，即得糖漿狀樣品。然后，用甲醇定容至50 mL，得到黃芪甲苷供試液。

1.4.2 甲苷對照品溶液制備準確稱取干燥至恒重的黃芪甲苷對照品適量，用80 %甲醇溶解，配制成濃度為0.32 mg/mL 的黃芪甲苷對照品溶液。

1.4.3 黃芪甲苷標準曲線的建立分別準確吸取0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL 配制好的黃芪甲苷對照品溶液，置于6 只10 mL 具塞比色管中；向6 只具塞比色管加入0.2 mL5%香草醛-冰醋酸， 再分別加入0.8 mL 高氯酸溶液，輕微振蕩混勻，置 70 ℃水浴15 min 后取出，置于冰浴中；分別向樣品中緩慢加入5 mL 純冰醋酸溶液，取出，搖勻，至室溫，再用80%乙醇定容至刻度。

以相應試劑為空白，利用紫外-可見分光光度法測定樣品溶液的吸光度值，測定波長為578 nm；以溶液濃度（c）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制工作曲線，得到線性回歸方程為：

相關系數r=0.999 2， 黃芪甲苷工作曲線的線性范圍為1.6～25.6 μg/mL，線性回歸方程在線性范圍內呈現良好的線性關系。

測定黃芪甲苷提取液含量的方法類同。

1.4.4 黃芪甲苷含量的測定取一定量已制備好的黃芪甲苷供試液，按照“1.4.3”方法測定黃芪甲苷含量。

2 方法學驗證

2.1 儀器精密度試驗

精密吸取一定量的黃芪甲苷對照品溶液，測定其黃芪甲苷得率。 測定6 次，計算測定結果相對標準偏差 RSD 值。 經測定，RSD 值為 2.5%，這表明 6 次測定結果的相對標準偏差符合要求，該儀器精密度良好。

2.2 重復性試驗

取同批等量的6 份黃芪樣品進行黃芪甲苷的提取，測定其黃芪甲苷得率，計算6 次得率的RSD 值。經測定，RSD 值為2.2%，這表明本試驗采用的測定方法的重現性良好。

2.3 穩定性試驗

精密吸取黃芪甲苷供試品溶液， 分別在制備0，2，4，8，10 h 后進行黃芪甲苷含量測定， 計算其RSD 值。經測定，RSD 值為0.78%，這表明本次測定的結果符合要求，黃芪甲苷溶液在10 h 內穩定性良好。

2.4 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的黃芪粉末1.0 g 共18 份，每組 3 份， 分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，加入其中，測定其黃芪甲苷得率。 經測定計算， 得到回收率94.7%，RSD 值1.4%。

2.5 正交試驗法設計黃芪甲苷提取工藝

采用正交試驗法設計黃芪甲苷提取工藝，選取對黃芪甲苷提取效率影響較大的料液比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為主要影響因素，以黃芪甲苷提取量為考察指標，采用醇提法提取黃芪甲苷，采用四因素三水平L9（34）正交試驗設計見表1，試驗結果見表2。 通過對各個參數進行優化，以獲得高提取率的關鍵工藝參數組合。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test factor levels

表2 正交試驗極差分析結果Table 2 Results of orthogonal test range analysis

由表2 正交試驗極差分析得知，在選定的試驗范圍內， 影響黃芪甲苷提取量的因素順序為：B＞C＞D＞A，即乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比，其影響最顯著的是乙醇濃度。綜合考慮影響黃芪甲苷提取量的因素水平，選取的最優參數組合為A1B3C3D3，即最佳的提取條件為：乙醇濃度90%，提取溫度80 ℃，提取時間120 min，料液比1∶16。按此條件在正交表的9次試驗中第3 個試驗出現，測定結果得到黃芪甲苷的提取量為96.89 mg/4.0 g。

3 結語

通過方法學驗證及正交試驗，對料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間4 個關鍵提取工藝參數進行優化， 得出黃芪藥材中黃芪甲苷的提取工藝參數為：料液比1∶16，乙醇濃度90%，提取溫度80 ℃，提取時間120 min，黃芪甲苷提取量為96.89 mg/4.0 g。 該提取工藝方法合理，可為黃芪中黃芪甲苷的提取和工業化生產提供理論參考和技術支持。