基因檢測在精準醫療中的應用與管理

侯英勇，錢夢佳，程韻楓，3，郭 瑋，彭明婷，肖艷群，王向東，顧建英

1.復旦大學附屬中山醫院病理科，上海 200032

2.復旦大學附屬中山醫院臨床醫學研究院，上海 200032

3.復旦大學附屬中山醫院血液科，上海 200032

4.復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032

5.北京醫院國家衛生健康委臨床檢驗中心，北京 100005

6.上海市臨床檢驗中心，上海 200126

7.復旦大學附屬中山醫院整形外科，上海 200032

基因是指具有遺傳效應的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段。其結構、功能等與生命體的各項體征密切相關。隨著現代醫學的發展，基因序列信息逐漸成為臨床疾病分子診斷精確的判定依據。基因檢測技術為運用各種分子生物學方法，并結合生物化學、遺傳學、臨床醫學、信息學等多學科綜合研究、解密基因這一生命密碼的基本手段。鑒于基因檢測技術已逐步推廣，經病理學、檢驗醫學、精準醫學等領域的專家共同探討后，本文概述了基因檢測在精準醫療中的應用與管理。

1 基因檢測的應用

1.1 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應（PCR）是一種酶促化學反應，可將待測目的基因在很短的時間內擴增50萬倍乃至上百萬倍，提高了基因診斷的靈敏度，降低了分析難度。常規PCR平臺可應用于檢測單核苷酸多態性、基因點突變或缺失、雜合型缺失及甲基化等。實時熒光定量PCR可應用于各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價，也可用于單核苷酸多態性、基因點突變或缺失、雜合型缺失及甲基化等檢測。擴增阻滯突變系統PCR（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）可實現對基因突變樣本的高特異性和高靈敏度檢測，通過熒光凈升曲線和Ct（cycle threshold）值判讀結果［1］。國家藥品監督管理局已批準多款ARMSPCR相關產品上市，以滿足臨床上對單基因及多基因聯合檢測的需求。數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）不依賴標準品或參考品而能直接定量目標基因拷貝數，可用于檢測復雜背景下的目標基因序列，并高度耐受PCR反應抑制劑［2］。ddPCR技術可達到千分級甚至萬分級的靈敏度，但檢測通量較低。

1.2 熒光原位雜交熒光原位雜交（FISH）是借助熒光探針標記基因序列以便于觀察的檢測技 術［3］。FISH可以實現DNA片段與基因之間相對位置、方向的準確定位，可檢測隱匿或微小染色體畸變及復雜核型，且費用較低，但判讀主觀性強，依賴于檢測人員的實踐經驗，且通量較小。FISH可應用于基因組研究、染色體精細結構變異分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學研究、病毒感染分析等。

1.3 一代測序一代測序為采用雙脫氧鏈終止法的經典測序技術。一代測序利用雙脫氧核苷酸能參與DNA復制卻因缺乏3′羥基而終止DNA合成的特性，在DNA合成反應體系中少量加入一種雙脫氧核苷酸，該雙脫氧核苷酸就會隨機摻入新合成的DNA鏈中，使反應體系中產生長短不一的DNA鏈（這些DNA的3′端堿基即為該雙脫氧核苷酸所含的堿基），最后進行4種含對應雙脫氧核苷酸的DNA復制，將反應后的DNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，從下往上進行讀序。一代測序讀取堿基準確率高、重復性好，且測序成本較低，但同時檢測靈敏度也較低、通量較小。Sanger測序平臺可應用于基礎生物學、生物技術、診斷等領域，如常見腫瘤用藥相關靶基因突變檢測、遺傳性疾病相關基因檢測、藥物基因多態性檢測，也可用于各型肝炎的基因分型和耐藥位點的檢測等。

1.4 二代測序高通量測序又稱為二代測序，能夠對幾十萬到幾百萬DNA分子同時進行平行測序，然后通過生物信息學分析得到原始圖像數據或電化學信號，最終得到待測樣品的核酸序列或拷貝數等信息。二代測序的檢測規模和通量大幅度提高，應用領域廣泛。二代測序目前廣泛應用于基因組DNA序列測定（微生物基因組測序、線粒體基因組測序等）和DNA擴增子測序等，得到的基因組信息豐富，并可進行變異分型和未知變異分析。

2 基因檢測全流程質量控制管理

國家衛生健康委員會辦公廳印發的新型抗腫瘤藥物臨床應用指導原則（2020年版）明確指出，對于有明確靶點的藥物，須經靶點檢測后方可使用。檢測所用的儀器設備、診斷試劑和檢測方法須獲得國家藥品監督管理局批準。因此，本文針對基因檢測實施的各個環節，包括實驗室人員配備、設備配置、環境準備、取樣、核酸提取、文庫制備、生物信息分析、報告解讀等，制定全流程的質量控制基本要求。全流程質控的根本目的是減少錯誤的發生，從每個環節確保靶點檢測結果的精準性。

2.1 實驗室人員、設備與環境要求

2.1.1 實驗室分區與規劃進行基因檢測的場所一般由多間實驗室組成，實驗室根據執行的功能不同應有明確的區域劃分，主要遵循4個原則。（1）各區獨立：實驗室各個區域的物理空間及實際使用過程中，都應當處于完全分隔狀態，并且各區域之間不能有空氣的直接流通；（2）單一流向：基因檢測通常涉及核酸純化富集和產物擴增等過程，任何樣本源性污染、擴增產物污染或氣溶膠污染均可能導致假陽性結果出現，因此各實驗區域間宜有一定的通風壓力差，保證合理的空氣流向，防止污染；（3）因地制宜，新建實驗室除合理、規范外，也須易于管理；（4）方便工作：實驗室區域選擇及空間設計應盡可能方便日常檢測工作，包括人員流動、大型儀器設備進出落地等。

2.1.2 實驗室資質要求臨床開展基因檢測首先需要有合理規范的檢測實驗室作為硬件支撐。臨床實驗室不是醫院的檢驗科或病理科，而是所有為臨床提供醫學檢驗服務的實驗室。《醫療機構臨床實驗室管理辦法》對實驗室的建設和規范提出了多項基本要求。此外，2010年發布的《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》對臨床基因擴增檢驗實驗室的設置、分區、儀器配備、人員培訓等提出了規范化要求。檢測技術涉及臨床基因擴增技術時，實驗室技術人員須通過相關技術理論與技能培訓并取得臨床基因擴增檢測實驗室人員上崗證。開展臨床分子病理檢測需要使用特定的檢測試劑，同時需要進行有效監管。

2.2 取樣環節的優化與質控基因檢測前階段是指從臨床醫師開具醫囑至將所獲樣本進行保存的過程。該階段涉及檢驗申請單的規范化填寫，受檢者信息采集和知情同意書簽訂，樣本采集、運送、接收，核酸樣本制備和保存等多個環節，是參與者身份最多最復雜的環節，因此需要嚴格要求流程中各環節人員遵守相關的規范化程序。

由于核酸的穩定性、結構完整性對檢測結果有決定性影響，因此樣本采集、運輸和保存是分析前質量控制最重要的環節。用于檢測的臨床樣本類型眾多，包括手術切除或活檢組織、胸腔積液、脫落細胞、外周血等，不同類型的樣本處理和保存的方法不相同，應結合實際情況，確保用于檢測的核酸樣本滿足質量控制要求。

2.3 核酸提取的優化與質控用于提取DNA的腫瘤組織樣本，應盡可能確定腫瘤細胞的百分比，選取以腫瘤細胞為主，且沒有明顯的壞死、黏液和炎性改變的組織進行檢測［4］。核酸提取后，應進行質量評價：（1）采用紫外吸收法測定吸光度（260/280 nm處）的數值，通過數值大小判斷DNA中是否存在RNA、蛋白質或提取過程殘留試劑的污染；（2）采用熒光染料法特異性結合DNA測定其有效濃度，建議總量在20～40 μg或40 μg以上，以方便下游檢測；（3）通過電泳法可以評估DNA長度 （特別是游離DNA長度）是否符合預期要求，并通過條帶分布的彌散性判斷DNA降解程度。符合各項要求的DNA存于TE（TRIs-EDTA）溶液中待用或長期保存。

RNA的提取質控與DNA基本相同，須特別注意的是提取過程中要嚴格防止RNA酶對其降解，可采用高溫滅菌處理的耗材及RNA保護劑保存RNA樣本。

從各種類型樣本中獲取的核酸的質量是基因檢測成功的關鍵因素，應綜合核酸濃度、純度、完整性、長度等因素進行質量分析，明確接受和拒絕標準。若質控失敗，則應考慮重新提取甚至重新選擇樣本。

2.4 文庫制備的優化與質控基于二代測序技術的基因檢測方法，需要對DNA樣本進行一系列處理，制備可在相應儀器上進行檢測的產物，通常稱之為“文庫”。文庫制備方法對于所涉及的試劑、引物探針、實驗條件都有明確的質量控制規范和要求，并且構建好的文庫也需要進行濃度、長度等質量控制，明確接受和拒絕標準。例如：通過雜交捕獲法建庫時，首先需要通過超聲、酶切等方式將基因組DNA處理成滿足測序長度要求的小片段（游離DNA無需進行片段化），而片段化的DNA滿足建庫用量需求、長度符合預期是進行下游建庫的質控前提。雜交捕獲法適用于靶向基因測序，在目標基因富集過程中，受特定基因序列GC含量、重復區域、擴增偏好性的影響，可能產生部分非特異性的富集，這部分比例過高將降低目標區域的有效數據量，因此對引物探針的優化和校驗尤為重要。

2.5 生物信息分析流程的搭建與質控對于二代測序基因檢測數據，需要結合生物信息學分析手段才能得到檢測結果。由于生物信息分析手段多樣，可選用的軟件較多，并且不同檢測流程的算法也有差異，實驗室應根據實際分析流程制定嚴格的質控程序。

生物信息分析可分為測序數據的質控處理及過濾、質控合格序列的變異位點鑒定分析2個主要步驟［5］。實驗室首先需要建立數據分析流程（pipeline）的標準操作規程，必須包含每次監測和評估運行性能的指標和質控參數，以及定期監測的指標和質控參數，可包括但不限于標準品的突變類型及百分比。生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類型和變異頻率的標準品對其進行驗證，評估其特異度和靈敏度是否達到實驗室要求，并將驗證結果簽名后留底備案［4］。

實驗室應記錄生物信息分析過程中使用的軟件和數據庫的升級或版本更新情況，以保證生物信息分析的可追溯性和檢測結果的再現性。應定義生物信息分析整體流程的版本號，當軟件更新時進行記錄，對更新后的流程重新進行性能確認并升級版本號，以便在檢測記錄中引用。此外，實驗室需要建立一個異常記錄文檔，用來記錄偏離生物信息分析標準流程的檢測。

2.6 報告解讀的優化與質控基因檢測完成后，需由相關專業人員出具真實可信的檢測報告。報告中檢測結果的解釋由臨床實驗室負責，臨床意義的解釋由臨床醫師負責，分析后的質量控制主要為報告的正確解讀［6］。

首先，報告內容應準確、清晰、明確和客觀，不可摻雜虛假內容，包括采集到的患者詳細信息、樣本類型及質量情況、檢測試劑性能和內容、檢測平臺及數據分析軟件版本、原始結果、檢測方法局限性、本次檢測的質控參數信息、操作及復核人員和檢測日期等信息都應詳細注明［7］。建議在報告首頁，針對報告內容作檢測小結，可包括體細胞變異、胚系變異、具有臨床意義變異、可能獲益藥物等信息，使臨床醫師能快速了解報告的核心內容。

其次，結果的解釋應由相應專業人員進行書寫。基因名稱可參考HUGO基因命名委員會（HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC）。基因變異的書寫格式可參考人類基因組 變 異 協 會（Human Genome Variation Society，HGVS）的建議；體細胞變異可參考分子病理學協會（Association for Molecular Pathology， AMP）、美 國臨 床腫 瘤 學 會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）和美國病理學家協會（the College of American Pathologists，CAP）在2017年發布的腫瘤體細胞變異解釋標準指南，報告各個檢測到的變異位點及臨床意義；胚系突變可參考美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）在2015 年發布的遺傳變異分類指南，對檢測到的變異位點的致病性予以相應的臨床解釋［4］。

3 小 結

通過探討基因檢測在精準醫療中的應用與管理，明確基因檢測應用方法，同時對基因檢測每一步驟的質量控制及改進優化提出要求，希望能為所有從事精準醫療檢測的實驗室提供參考，進而不斷提高及改進檢測質量，更好地為精準醫療服務。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。