腎上皮細胞損傷與腎結石Randall斑塊形成

楊 雄，靳瀟瀟，何文強

(1.河南中醫藥大學, 河南 鄭州 450046; 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院, 河南 鄭州 450003)

泌尿系結石是一種常見的疾病，晶體物質游離或附著在腎乳頭上是結石形成的基礎，研究發現全世界結石的發病率正在上升[1]。在結石形成因素里，代謝類相關疾病被認為是結石形成常見的危險因素[2]。腎結石(kidney stones)由有機物和晶體聚集組成，在尿液相關物質過飽和的情況下形成。草酸鈣是大多數結石的主要成分，其中許多是在Randall斑塊(Randall’s plaque)的磷酸鈣基礎上形成的，Randall斑塊存在于腎乳頭細胞表面。目前腎上皮細胞損傷與Randall斑塊兩者之間的關系并沒有研究給予以說明。本文對近幾年兩者之間關系的研究現狀展開綜述，以便為草酸鈣結石的臨床診療提供相應的參考。

1 Randall斑塊形成理論

在腎結石形成機制一系列學說中， Randall斑塊學說目前得到普遍的認可。對患有腎結石病變的腎乳頭研究時，發現特異性鈣結石附著在Randall斑塊基礎上形成的[3]， 并證實了庫克(Cooke CR)關于Henle環(Henle’s loop)基底膜參與Randall斑塊形成的結論。Henle環由降支細段、升支細段和升支粗段組成，通過逆流倍增和交換機制從尿液中回收水和溶質，降支細段和升支細段上皮細胞較少，細胞器相對較少，因而代謝水平低。然而升支粗段上皮細胞較多，細胞的代謝活性較強，Henle環粗大的上升支在腎臟的水和電解質處理以及維持酸堿平衡中起著核心作用，并通過鈉鉀泵及Na+-K+-2Cl-同向轉運體(Na+-K+-2Cl-cotransporter type2，NKCC2)發揮作用。Henle環升支粗段通過細胞旁途徑對鈣重吸收[4]，新近研究的結果表明鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)直接調節緊密連接蛋白claudin-14和claudin-16的表達[5]，進而促進對鈣的重吸收。Henle環升支粗段鈣敏感受體及緊密連接蛋白的缺乏，將導致高鈣尿癥和結石的形成。誘發Randall斑塊成的兩個關鍵因素是尿量和尿液成分，升高的尿鈣刺激磷酸鈣(calcium phosphate，CaP)晶體形成，該晶體破壞腎小管上皮細胞促進腎間質內聚集形成栓塞和斑塊，或通過尿液排出體外[6]。尿液中草酸鈣結晶、感染或其他原因引起腎上皮細胞的損傷，使Randall斑塊暴露于異常尿液的環境中，導致斑塊表面與尿液中的草酸、鈣離子的結合，進而有利于草酸鈣結石形成。Randall斑塊是在腎小管上皮細胞下形成的沉淀物，上皮組織被破壞及晶體的形成是草酸鈣結石形成的重要一步。隨著時間的推移，持續暴露在這種環境中有助于晶體附著，并促進結石的生長和保留。

2 腎上皮細胞成骨樣改變與斑塊

通過對斑塊形成的臨床和實驗研究發現，血管鈣化與Randall斑塊存在相似性形成機制。Randall斑塊的形成機制可能與上皮細胞的損傷、缺氧、高滲等刺激有關，從而促進腎上皮細胞向成骨樣細胞分化[7]。隨著對尿液成分的深入研究，高草酸尿癥、高鈣尿癥、低檸檬酸尿癥和低焦磷酸尿癥會造成腎上皮細胞處于異常環境中，促使腎上皮細胞向成骨細胞轉化。通過對雄性使用羥基脯氨酸(hydroxy-l-proline，HLP)誘導高草酸尿癥和小管內草酸鈣晶體沉積的大鼠模型中[8],對全基因組分析發現上皮細胞脫分化為成骨細胞的病理改變，發現骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2，BMP2)、相關轉錄因子2(related transcription factors 2，RUNX2)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)等相關因子增加。鑒于以上研究推測：黏附在腎小管細胞上的草酸鈣晶體通過骨橋蛋白的參與而結合到細胞中，晶體細胞黏附的刺激損害了管狀細胞中線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放，并產生氧化應激、凋亡和骨橋蛋白表達，從而造成腎上皮細胞的損傷。將人腎近端小管上皮細胞暴露于磷酸鈣中[9]，在培養物中也誘導了CaP沉積。這些細胞聚集形成結節，以凋亡細胞和晶體沉積的形式存在，并表達一些成骨標志物，如RUNX2、骨連接蛋白、骨橋蛋白和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)。在用草酸鈣處理體外腎上皮細胞模型和體內培養的小鼠腎結石模型中，骨橋蛋白表達量的增加與Randall斑塊的形成有密切聯系[10]。其中一些上調的基因產物在上皮細胞成骨樣改變中起作用，包括骨橋蛋白和骨鈣素等物質。骨橋蛋白是一種成骨性標志蛋白，也具有礦化調節劑的作用，在腎結石的形成中起這重要的作用。它既可以作為晶體成核和生長的抑制劑，也可以作為鈣化晶體成核的促進劑，而且是動脈粥樣硬化斑塊、Randall斑塊、結石和晶體中普遍存在的成分。這些研究進一步表明，尿液中草酸，鈣離子可導致腎上皮細胞的損傷，并促進成骨樣相關因子及蛋白質表達增加，使上皮細胞向成骨細胞轉化，有利于腎小管上皮細胞基底膜形成鈣化晶體和Randall斑塊，為腎結石的形成提供條件。

3 活性氧和炎性反應與斑塊

正常情況下細胞內同時存在生成活性氧(reactive oxygen species,ROS)的體系和拮抗其生成的抗氧化劑體系，當細胞內ROS生成增多，通過生物膜脂質過氧化、線粒體功能異常引起細胞的損傷，ROS的過度產生導致氧化應激，這與許多疾病有關。腎小管液中草酸鈣和磷酸鈣結晶的增加激活腎上皮細胞中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶的產生，NADPH氧化酶與p47phox等6種亞基結合，形成具有活性的氧化酶復合體，并促進大量活性氧(ROS)向腎小管上皮細胞的釋放[11]。草酸鈣等物質引起細胞氧化應激反應也可以通過線粒體膜電位的改變產生，進而導致細胞色素C釋放到胞質溶膠中并導致細胞凋亡[12]。在探究條斑紫菜多糖(porphyra yezoensis polysaccharide,PYP)對草酸鹽誘導的氧化應激介導的腎小管上皮細胞(HK-2)損傷的修復作用時，發現PYP降低了草酸鹽介導的乳糖脫氫酶釋放、活性氧生成和細胞內Ca2+的水平、線粒體膜電位的損失，進而修復受損細胞、抑制晶體黏附和聚集來抑制腎結石的形成[13]，PYP可作為一種抗氧化劑用來預防腎上皮細胞的損傷及結石的形成。以上研究表明，活性氧參與腎小管上皮細胞的氧化應激損傷，活性氧可以使線粒體膜發生異常，使跨膜電位降低，導致細胞發生凋亡。當晶體誘導腎小管上皮細胞發生凋亡時，晶體的黏附力顯著增加促進Randall斑塊的形成。因此，草酸鈣晶體誘導的腎小管上皮細胞氧化應激損傷和凋亡在腎結石的形成中起著重要的作用。

在使用微陣列和免疫組織學來比較23例草酸鈣結石患者(年齡和性別匹配)腎乳頭狀Randall斑塊(renal papillary,RP)、非RP組織及7名對照組正常乳頭狀組織的基因表達。透射電鏡顯示RP內部和周圍均有OPN和膠原蛋白表達[14]，RP組織中脂質運載蛋白-2(lipocalin-2,LCN-2)、白介素-11(interleukin-11,IL-11)、環加氧酶-1(cyclooxygenase-1,PTGS-1)、谷胱甘肽過氧化物酶-3(glutathione peroxidase-3，GPX3)、單核細胞向巨噬細胞分化(monocyte to macrophage differentiation，MMD)上調，這些基因與激活的絲裂原活化蛋白激酶、Akt/磷脂酰肌醇3激酶通路以及導致腎臟損傷和氧化應激的促炎細胞因子相關。與正常非斑塊組織相比，Randall斑塊腎組織中免疫細胞的數量和細胞凋亡水平也增加。這些發現表明腎上皮細胞發生炎性反應、氧化應激和凋亡與CaP晶體的沉積和Randall斑塊的形成有關。

4 巨噬細胞與斑塊

尿液中草酸、鈣離子異常是腎結石發病的危險因素，可誘發腎上皮細胞的損傷，促進管腔內晶體的形成，附著的晶體可以通過尿液排出體外，也可以被保留并附著在腎上皮細胞上。在對乙二醇致大鼠鈣性腎結石模型進行研究中發現[15]，小管內腎晶體沉積的數量在第6天達到峰值，并且在第15天檢測不到，這一過程解釋了正常腎小管具有晶體清除能力。對腎結石患者腎乳頭組織中表達基因的分析顯示，結石的形成與炎性巨噬細胞表型(也稱為M1表型)相關的基因上調和抗炎性巨噬細胞表型(也稱為M2表型)相關的基因下調有關[16]。初期暴露在晶體中會使巨噬細胞向抗炎表型分化，抗炎巨噬細胞通過溶酶體加工吞噬和破壞晶體。然而，長時間暴露在晶體中可能會使巨噬細胞向促炎表型分化，炎性巨噬細胞可產生大量ROS,進而誘導細胞釋放炎性因子，這些反應的直接導致了腎小管上皮細胞的損傷[17]。因此，巨噬細胞在炎性細胞因子長期刺激下，使巨噬細胞向促炎性巨噬細胞分化。促炎性巨噬細胞增加的同時抗炎性巨噬細胞的減少將進一步維持炎性反應微環境，進而促進晶體成核和黏附，從而導致Randall斑塊的形成。

5 長鏈非編碼RNA與Randall斑塊

隨著對基因組的深入研究，大量的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，IncRNA)被發現，IncRNA的突變或失調與疾病的發生和發展有密切的關系。H19是最早鑒定和最具特征的長鏈非編碼核糖核酸之一，研究表明H19參與炎性反應調節并誘導組織損傷[18]。在乙醛酸誘導的草酸鈣腎結石小鼠模型中，長鏈非編碼RNA-H19表達顯著增加，并與HMGB1、TLR4和NF-κB信號通路表達炎性反應因子呈正相關[19]，炎性反應因子表達的增加誘導的氧化應激、NADPH氧化酶和腎小管上皮細胞損傷。H19被認為是一種炎性反應調節劑，在腎小管上皮細胞損傷及在晶體黏附中其促進作用。最近的研究發現，在一水草酸鈣(calcium oxalate monohydrate，COM)處理的人類近端腎小管上皮細胞(HK-2)中有9種高表達的IncRNAs，其中長鏈非編碼編RNA339(LINC00339)表現出最高的上調水平[20]，LINC00339在腎結石的形成中存在潛在作用。用草酸鈣處理人近端腎小管上皮細胞建立體外腎小管損傷的細胞模型[21]，發現LINC00339有miR-22-3p的結合位點，且NLRP3的mRNA中包含miR-22-3p結合序列，NLRP3被認為是miR-22-3p的靶基因，進行熒光素酶報告分析以驗證miR-22-3p結合LINC00339或NLRP3。LINC00339的表達水平升高，NLRP3炎性小體促進炎性因子增加，進一步增加腎小管上皮細胞損傷。腎上皮細胞的損傷可誘導炎性反應和巨噬細胞的發生，進而促進Randall斑塊的形成。因此，發現H19、LINC00339可能是腎結石治療中保護腎細胞的有效治療靶點。

6 治療

血脂異常(心血管疾病的一個重要危險因素)的患者患腎結石的風險很高。他汀類藥物(抗感染和降低膽固醇藥物)與結石形成風險降低相關，他汀類藥物通過提高一氧化氮的生物利用度和降低氧化應激來保護內皮細胞，從而降低腎小管上皮細胞的損傷[22]。另一項研究表明使用他汀類藥物的患者更有可能接受噻嗪類利尿劑治療，噻嗪類藥物作用于遠端腎小管和近端小管，增加鈣的吸收，從而減少尿鈣的排泄，使鈣鹽在腎小管上的沉積減少[23]。這些藥有可能是未來治療和預防腎結石的重要策略之一。

最近一項結石病的免疫治療發現[24]，促進巨噬細胞向抗炎表型的極化，將抑制炎性反應發生并減少了草酸鈣晶體沉積。用ASC-J9(一種促進雄激素受體降解的藥物)治療高草酸尿大鼠中，與對照組相比晶體的量明顯減少，雄激素受體通過增加微小核糖核酸miR-185-5p的表達間接調節M2極化因子巨噬細胞集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1，CSF-1)的表達，miR-185-5p是一種小的非編碼核糖核酸，負調節CSF-1的翻譯[25]。因此ASC-J9作為一種結石治療藥物可促進M2極化并減少腎臟中的晶體沉積。然而此療法僅在大鼠體內研究應用，還需要長期臨床試驗證明是否對腎結石的發生產生效果。

7 問題與展望

目前對于Randall斑塊形成的學說眾多，但是確切的形成機制尚未明確，而且研究基于對患者腎結石的檢查以及動物和細胞培養模型所了解得到的，目前缺乏一種真正代表腎小管上皮細胞下斑塊的草酸鈣結石動物模型。Randall斑塊與結石的形成是一個多步驟過程，其中腎上皮細胞損傷對結石形成具有重要的作用。然而腎上皮細胞的改變對Randall斑塊形成的研究是一個初級階段，還需要繼續研究Randall斑塊形成機制(代謝、基因及相關信號通路等方面)及對各種學說的驗證。以ROS和NLRP3炎性小體相關信號通路為靶點介導的氧化應激和炎性反應作為細胞的防御機制，與結石的聯系被越來越多的研究所證實。因此，未來針對相關通路和基因進行調控，可能有助于確定治療方案和預防腎結石的發生。