支氣管肺發育不良生物標志物的研究進展

任淑英 張勤

隨著越來越多的早產兒在肺發育的早期階段出生，肺發育不成熟導致的BPD(支氣管肺發育不良)的發生率逐漸增高，BPD帶來的遠期不良預后發生率也逐漸增多，主要包括呼吸及神經系統發育落后等不良影響。胎齡≤32周存活的嬰兒在校正胎齡36周仍需呼吸支持方可診斷BPD，導致臨床醫生對BPD的早期干預時間尚無統一意見，因此尋找BPD發生的早期線索是新生兒科醫師面臨的一項重大挑戰。本文將對一些早期預測BPD的生物標志物研究進展進行綜述，旨在早期識別BPD，指導臨床醫師早期干預，從而降低遠期不良預后，提高患兒的生存質量。

炎癥細胞因子

炎癥是BPD發生的一個重要環節，持續的炎癥反應是BPD的主要病理機制，BPD發生的各個環節有許多的炎癥細胞因子參與，可以通過不同的細胞因子預測BPD的發生。

一、調節性T細胞(T regulatory cells,Tregs)

調節性T細胞是具有免疫調控作用的一類T細胞亞群，它可以抑制其他T細胞的活化，從而調節免疫功能和誘導免疫耐受。采用流式細胞儀檢測臍血Tregs數量，結果發現Tregs數量和BPD的嚴重程度呈負相關，Tregs通過促進IL-10、TGF-β的分泌維持免疫平衡；另一方面，Tregs細胞數目減少可能與其浸潤在炎癥損傷的肺組織中有關[1]。薛立軍等人[2]研究發現胎齡<32周的BPD早產兒出生時臍血Tregs數量明顯低于非BPD早產兒，Tregs數量減少是早產兒發生BPD的危險因素。BPD新生兒的Tregs和非調節性T細胞數量明顯減低，且BPD早產兒存在促炎CD4+T細胞狀態，BPD的發生和Tregs的減少有關[3]。對早產兒外周血CD3+CD4+CD25+FoxP3+Treg頻率分析發現，Tregs的頻率和功能較足月兒和成人明顯增加，表現出明顯的表型，且在第2周時頻率達峰值，持續高頻率Tregs可能導致持續性的炎癥反應，從而引起BPD發生；通過比較胎齡<29周出生的BPD和非BPD的早產兒發現，BPD早產兒第4～10天的Tregs頻率明顯增高(P=0.0343)[4]。目前認為Tregs數量減少及頻率的增加，可能增加早產兒發生BPD的風險，檢測Tregs數量可作為早產兒發生BPD及評估嚴重程度的預測指標，尚需對Tregs表型進行功能分析，以明確其是否有潛力作為BPD診斷和治療的未來靶點。

二、血漿轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)

TGF-β屬于轉化生長因子超家族中的一種多功能細胞因子，它的關鍵功能是調節炎癥反應，在干細胞分化以及T細胞調節及分化中也起著重要作用。TGF-β1是其中一種亞型，由肺泡巨噬細胞產生，當其過量表達時會通過多種途徑抑制肺泡發育，導致肺纖維化及BPD的發生[5]。Aly H.等[6]研究發現，BPD組早產兒氣管吸出物中的TGF-β1的表達水平較非BPD組明顯增高，Li C.等[7]檢測血清中的TGF-β1發現同樣的結論。楊智全等[8]報道，BPD組早產兒生后28天內隨時間推移TGF-β1水平逐漸升高，高于同時間點非BPD者，且BPD程度越嚴重TGF-β1水平差異越顯著，多因素Logistic回歸分析提示TGF-β1、Treg均是BPD的獨立危險因素，二者聯合預測BPD價值更高。動物研究發現，暴露于高氧環境下的新生小鼠肺泡發育受損、彈性蛋白沉積及TGF-β信號過度激活，導致BPD發生；TGF-β中和抗體通過阻斷TGF-β信號通路和減少氧氣暴露，抑制新生小鼠肺中彈性蛋白的異常表達從而改善肺泡形成[9]。目前已經有動物研究證明，孟魯司特可以通過滅活TGF-β1/Smads信號通路減少BPD的發生[10]。早產兒高氧暴露后，通過TGF-β信號過度激活，血清或氣管吸出物中TGF-β1水平增高，抑制肺泡發育、加速肺組織纖維化，導致BPD發生。TGF-β中和抗體有可能成為一種新的預防BPD的方法。

三、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipid carrier protein ,NGAL)

NGAL是載脂蛋白家族中的一員，主要存在于中性粒細胞過氧化物酶陰性的一些顆粒中，同時也在肺、腎臟、子宮等其他組織中表達。NGAL主要與腫瘤、急性腎損傷、炎癥、代謝等密切相關，當機體出現炎癥、代謝紊亂以及細胞分化異常時，血清中的NGAL水平會升高，現常作為腎臟疾病的標志物之一[11]。賀娟等人[12]檢測了在不同日齡80例早產兒外周血中NGAL及Ⅱ型肺泡細胞表面抗原-6(Krebs von den lungen-6，KL-6)水平，結果發現BPD組24小時內、7天以及14天NGAL水平，7天、14天時的KL-6水平均較非BPD組明顯增高，提示NGAL、KL-6與BPD發生有關。對36名胎齡<31周的早產兒進行的多變量分析發現，出生時較高的NGAL水平(≥82 ng/mL)與BPD的發生有顯著相關性(P<0.01)[13]。研究報道，血清25(OH)D3≤10ng/mL、NGAL≥100μg/L是發生支氣管肺發育不良的獨立危險因素[14]。NGAL臨床簡單易檢測，與其他標志物結合對BPD的早期預測有重要作用，但其臨床應用價值需要多中心大樣本的數據的檢驗及證實。

四、白細胞介素(interleukin，IL)

動物實驗發現，小鼠肺3型固有淋巴樣細胞來源的IL-17和IL-22的分泌與BPD有關[15]。國外一項隊列研究發現，早產兒生后第1天BPD組的唾液中IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、和干擾素-γ水平顯著高于對照組，因此早期唾液炎癥細胞因子水平和BPD的發生有關[16]。一項前瞻性研究中，對新生兒出生后第14天、28天分別檢測了血清IL-33水平，結果發現BPD患兒血清IL-33水平顯著高于非BPD者，且IL-33水平隨BPD嚴重程度和出生后的時間逐漸增加；中、重度BPD早產兒血清IL-33水平在常規糖皮質激素治療后顯著降低(P<0.05)[17]。但并不是所有的白介素都參與了BPD的發生，研究發現IL-4和IL-13水平與BPD的發生無關[18]。多種白介素可能和BPD的發生及嚴重程度有關，通過不同檢測方式為早期無創預測BPD提供了新的思路，白介素受體拮抗劑有可能成為改善BPD預后的一種有效治療措施。

五、其他生長因子

早產和吸氧等相關的肺損傷因素導致肺微血管發育停滯和肺泡結構簡化，是BPD的重要病理機制，多種生長因子參與肺微血管生成的過程，從而參與了BPD的發生。

BPD可能與新生兒生后第1周血清中血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)水平低有關[19]。檢測高氧誘導的急性肺損傷新生鼠第7天VEGF、血管生成素-1(Ang-1)的mRNA及蛋白表達水平，結果發現高氧組第7天的VEGF、Ang-1表達水平較對照組明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)。此實驗同時觀察了光鏡下的肺組織，可見隨著吸氧時間延長，肺微血管發育受阻，肺泡數目變少，肺泡結構簡單化以及肺分化發育受阻[20]。胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor，IGF-1)主要在肺泡的形成及肺組織損傷的愈合過程中，影響BPD的發生、發展[21]。但是也有研究證明，4種促/抗血管生成因子血清sFlt-1(可溶性血管內皮生長因子受體-1)、P lGF(胎盤生長因子)和sEng(可溶性內啡肽)、TGF-β水平與母親為子癇前期且胎兒宮內生長受限的早產兒發生BPD無相關性[22]。各種生長因子是肺血管及肺泡發育過程中不可或缺的重要調節因子，早期檢測有可能有助于BPD的預測，目前尚未廣泛應用于臨床，繼續探索將有利于BPD的發病機制及和治療策略的研究。

六、中性粒細胞和淋巴細胞比值(Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio，NLR)

NLR是一種臨床炎癥標志物，和許多肺部疾病如肺癌、肺炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等密切相關[23-25]。NLR值可間接評估炎癥狀態和細胞介導的免疫功能[26-27]。研究發現全血細胞中計算的NLR可以作為一種新生兒敗血癥的替代指標，和C反應蛋白聯合檢測價值更高[28]。BPD早產兒在出生時和72小時的NLR均高于非BPD者；預測BPD的72小時的NLR截斷值為3.035(敏感性=0.519，特異性=0.964)，AUC為0.714。此研究表明72小時的NLR的增高，可能是BPD尤其是嚴重BPD的早期預測指標，也可能是宮內感染早產兒發生BPD的標志[29]。另一項關于中性粒細胞和BPD的研究中發現，BPD早產兒外周血中性粒細胞計數明顯低于足月兒和未發生BPD早產兒，且此類早產兒在校正胎齡6月內容易發生肺炎，提示中性粒細胞減低和肺部炎癥的易感性有關[30]。NLR是一種經濟、易獲取的指標，目前關于NLR在BPD的早期預測方面的研究較少，其多與宮內感染導致的炎癥反應有關，而感染本來就是BPD發生的重要機制，希望未來更多研究證實其在BPD預測中的價值，為臨床簡便預測BPD提供新的思路。

非炎性生物標志物

一、紅細胞分布寬度(Red blood cell distribution width, RDW)

RDW是一種反映紅細胞大小的變異程度的指標，近期研究發現RDW水平和許多成人肺部疾病相關，如慢性阻塞性肺疾病、肺炎、肺癌等[31-33]。國外一項回顧性研究以176例胎齡<30周出生的早產兒為研究對象，檢測出生時、日齡14天及28天時血中RDW水平，結果發現BPD早產兒的RDW水平較非BPD者明顯增高，且28天時差異最顯著 ，不同程度BPD患兒之間RDW水平也有顯著差異，以日齡28天時的RDW>22.5%閾值的水平，預測BPD發生的敏感性為72%，特異性88%(P<0.001)[34]。分析其發生的可能機制為：BPD早產兒出生后有慢性缺氧，可刺激促紅細胞生成素生成增加，促進RDW水平的升高；另一方面，慢性炎癥反應參與BPD的發生，而炎癥可特異性地影響紅細胞的生成，引起RDW水平增高；炎癥因子可抑制血管內皮一氧化氮生成，進而導致紅系祖細胞生成障礙，刺激RDW水平增高[26]。陳琪[35]研究發現，在生命早期階段(第7、14天)，RDW水平升高和BPD發生具有相關性，RDW可以作為一種早期預測BPD的生物學指標?？傊琑DW對BPD可能有一定預測價值，且具有取材方便、檢測迅速、成本低廉等優點，但目前國內外相關研究較少，單獨預測BPD的價值有限，聯合其他生物標志物有可能提高預測價值。

二、可溶性Klotho蛋白(Soluble Klotho，sKL)

Klotho是1978年首次發現的一種抗衰老蛋白，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、血管保護作用等生物學效應[36]。 Klotho主要表達于腎臟和脈絡膜叢，胎盤、肺、甲狀旁腺和心臟等臟器中也存在少量表達[37]，sKL是人類Klotho蛋白的一種主要表達形式。Sunil等人[38]首次研究了臍血sKL水平與BPD及BPD引起的肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)的關系，結果發現BPD及BPD-PH的早產兒臍血sKL水平明顯低于非BPD組，補充sKL可改善嚴重BPD-PH大鼠模型的肺結構，減輕血管重構，減少心肌肥厚和功能障礙。sKL是發生BPD和BPD-PH風險的危險因素和生物標志物，通過提高sKL水平對新生兒早期干預，有可能是改善早產兒心肺預后的有效策略。這是第一個關于sKL和BPD關系的研究，未來需要進一步的研究來證實Klotho對肺部及其他器官系統的影響，以便更好地應用于臨床實踐。

三、N末端前體腦利鈉肽(N-terminal precursor brain natriuretic peptide,NT-proBNP)

NT-proBNP屬于心臟利鈉肽家族中的一員，由心室肌細胞合成和分泌的利鈉肽原裂解生成。NT-proBNP無生物活性、血漿濃度較高、體內穩定性好，臨床檢測中應用較多，目前發現其與多種新生兒疾病具有相關性，如動脈導管未閉、新生兒呼吸窘迫綜合征、心力衰竭等。研究發現，中度/重度BPD或死亡的早產兒生后第一天檢測血清NT-proBNP水平顯著高于輕度/非BPD早產兒(P<0.001)，ROC曲線分析顯示，NT-proBNP水平為2002.5 pg/mL時預測中度/重度BPD或死亡的敏感性為87.5%，特異性為74.7%。曲線下面積(AUC)為0.853 (95% CI 0.792～0.914)[39- 40]。NT-proBNP在判斷中度至重度BPD方面預測準確性較高。國外一項前瞻性研究檢測了生后28天早產兒的NT-proBNP水平，同樣發現中重度BPD早產兒較輕度或非BPD者明顯升高，且NT-proBNP對診斷中度至重度BPD具有良好的預測準確性(AUC為0.68)[41]。另一項研究中，發生BPD和/或死亡的嬰兒在生后48～96小時和5～10天時NT-proBNP水平均較非BPD者高，且5～10天NT-proBNP水平與BPD和/或死亡獨立相關，NT-proBNP對于發生BPD和/或死亡預測的截斷值為3348ng/L，敏感性和特異性分別為82%和83%(AUC=0.87；95%置信區間:0.79～0.95)[42]。NT-proBNP目前更多作為BPD-PH及死亡早期預測指標[43]。但是也有學者將BNP及NT-proBNP水平與同時間段內的超聲心動圖比較，認為二者和左室收縮壓沒有相關性，提示BNP及NT-proBNP水平，不一定能準確反映肺動脈壓力程度[44]。NT-proBNP檢測方法操作簡便，穩定性好，預測中重度BPD及BPD-PH的敏感性及特異性均較高，探討NT-proBNP在BPD預測中的最佳檢測時間及其和心臟血流動力學的關系將有助于提高預測BPD及BPD-PH的準確性。

小 結

綜上所述，尋找預測BPD的生物標志物對于BPD的早期干預以及預后改善至關重要。目前臨床上尚未找到滿意的標志物及預測指標，可能和其預測價值不高有關，且大多數相關研究為小樣本、單中心性，容易產生結果偏倚。探索BPD生物標志物有助于理解BPD發生的病理生理機制以及尋找BPD潛在的治療策略。期待未來更多多中心、大規模的研究，以便于找到簡便、經濟、預測價值更高的生物標志物，實現對BPD高風險早產兒的早期預測、早期干預，降低不良結局的發生，減輕家庭及社會負擔。