青蒿素類衍生物抗肝癌作用機制及聯合用藥研究進展

樓衷晗 包劍鋒

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是嚴重威脅人類生命健康的疾病，約占原發性肝癌的90%，其死亡率在腫瘤相關死亡病例中位居第三[1]。對于HCC患者，最好的治療方法是手術切除，然而只有一部分患者適合接受根治性手術，且即使是適合根治性手術的患者，其復發的風險也很高[2]。此外，HCC患者治療過程中所使用的靶向藥和化療藥療效不佳，不良反應明顯，且會面臨耐藥的窘境，因此大多數 HCC 患者預后較差[3]。青蒿素（artemisinin，ARS）是臨床上常用的抗瘧藥物，目前已陸續開發出了青蒿琥酯（artesunate，ART）、雙氫青蒿素（dihydroarteannuin，DHA）、蒿甲醚等多種 ARS 類衍生物[4]，近年來研究發現ARS類衍生物的作用并不局限于治療瘧疾，它還可能對包括癌癥在內的其他數種疾病有治療意義。其中ART和DHA是ARS中活性較強的衍生物[5]，對人HCC細胞有明顯的抑制作用，而對非腫瘤正常肝細胞的毒性更低，且不易產生耐藥性[6]，具有成為治療HCC新藥物的潛在可能性。因此本文就ARS類衍生物抗HCC作用機制及聯合用藥研究進展作一綜述，為發掘這個經典抗瘧疾藥在HCC治療方面的新用途提供思路。

1 ARS類衍生物抗HCC作用機制

ARS類衍生物抑制腫瘤生長的機制尚不完全清楚，其中最有可能的機制是ARS類衍生物以多種特定方式同時表現出幾種抗HCC的作用模式。

1.1 活性氧（ROS）簇介導的細胞毒反應 內源性過氧化物（即ARS過氧鍵）會在游離亞鐵（Fe2+）存在的條件下裂解而致ROS的形成，導致氧化應激，引起細胞氧化性損傷，最終使細胞死亡[7]。腫瘤細胞的增殖轉移需要大量Fe2+及更高的鐵利用率，而正常細胞由于攝鐵能力正常則不受影響。與正常細胞相比，高水平的可變鐵庫（LIP）是腫瘤細胞異常增殖、耐藥的重要物質和代謝基礎[8-9]，因此推測ARS類衍生物正是利用ROS介導的基本細胞毒反應而達到抗腫瘤的生物活性，ROS和Fe2+增強了ARS對HCC細胞的細胞毒反應。研究發現，ART可以調節多個HCC細胞的LIP，并可有效誘導ROS依賴性的HCC細胞死亡，其機制是ART通過酸化溶酶體促進儲鐵蛋白的溶酶體降解從而增加了LIP，因此Fe2+在內質網中累積，促進了ROS的過量產生和嚴重的內質網破壞，從而導致HCC細胞死亡[10]。另有研究結果同樣顯示ART抗HCC作用機制為其可促進ROS積累的能力，ROS通過氧化脂質、蛋白質和DNA對HCC細胞產生毒性，最終導致細胞損傷或基因組不穩定[11]。

1.2 細胞程序性死亡

1.2.1 誘導細胞凋亡 細胞凋亡為細胞程序性死亡，是細胞死亡的方式之一。一般來說，細胞凋亡的途徑可分為內源性途徑和外源性途徑，內源性途徑又稱線粒體途徑，由氧化應激和DNA損傷觸發；外源性途徑為受體介導途徑，由死亡受體激活啟動[12]。介導凋亡的重要因子有B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）家族（促凋亡蛋白 Bax、Bim、Bid、Bak、Noxa等）、抑凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白（Caspase-8/9/10為啟動者，Caspase-3/6/7為執行者）、p53蛋白、細胞色素C以及凋亡蛋白激活因子1基因[13-14]。Zhang等[15]首次發現DHA誘導HCC細胞凋亡依賴于Caspase級聯反應（Caspase-3/9），Bcl-2家族蛋白也可通過調節線粒體膜通透性來調控線粒體凋亡誘導因子向細胞質釋放（DHA激活Bak），另外抑癌基因p53可能在DHA誘導的細胞凋亡過程中起部分促進作用。Hou等[6]研究證實了p53在細胞凋亡中的促進作用，并發現ART與DHA誘導HCC細胞凋亡是通過激活Caspase-3、增加Bax/Bcl-2比值和多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶含量，進而下調鼠雙微粒體-2基因（MDM2）實現的（MDM2被認為是癌癥預防和治療的分子靶標）。然而，另有兩項研究發現Caspase-8也參與了DHA誘導的外源性和內源性細胞凋亡途徑[16-17]，其中Qin等[17]推斷Caspase-8和Caspase-9獨立激活了Caspase-3介導DHA誘導的HCC細胞凋亡，此外他們進一步總結了DHA誘導HCC細胞凋亡的信號通路，即DHA誘導的ROS觸發了內源性和較小程度上不涉及Bid的外源性細胞凋亡途徑，Bim和較小程度的Noxa優先激活Bak的內源性凋亡途徑。

1.2.2 非凋亡性細胞死亡 除細胞凋亡外，還有其他程序性死亡方式，如細胞自噬、鐵死亡等。目前研究發現細胞自噬的調節主要涉及的信號通路以單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路為核心[18]。AMPK可促進細胞自噬發生，而mTOR則抑制自噬發生[19]。重組人絲氨酸-蘇氨酸激酶（AKT）-mTOR信號傳導是細胞自噬的關鍵負調節因子，Zou等[20]研究發現DHA可通過抑制AKT-mTOR途徑使蛋白輕鏈3-Ⅱ/蛋白輕鏈3-Ⅰ比值增加進而誘導HepG2細胞自噬，且該研究推測DHA可能是通過下調端粒保護蛋白重組人三肽基肽酶Ⅰ（TPP1）的表達來發揮抗癌作用的。TPP1的基本功能是阻止毛細血管擴張性共濟失調突變和RAD3相關激酶依賴的DNA損傷反應，在正常的細胞功能維持中起著至關重要的作用。Shi等[21]同樣認為DHA抑制HePG2細胞是通過細胞自噬介導的，在細胞自噬中，ROS的產生可致細胞核和線粒體DNA損傷，且該研究首次發現DHA能促進黑色素瘤缺乏因子2/Caspase-1炎癥體的形成，該機制有助于促進HePG2細胞自噬。

鐵死亡是2012年所發現的一種細胞死亡方式[22]。國內有學者發現DHA可誘導HCC細胞內谷胱甘肽含量下降，并能下調鐵死亡相關蛋白質谷胱甘肽過氧化物酶4蛋白水平，推測DHA可通過誘導HCC細胞發生鐵死亡來抑制其生長[23]。而最新研究發現ART可激活溶酶體功能，并促進HCC細胞中鐵蛋白的降解和Fe2+的釋放，誘導HCC細胞鐵死亡[24]。

1.3 細胞周期阻滯 腫瘤細胞周期的失控使細胞獲得了增殖過多的失控性生長特征。細胞周期調控機制的核心是細胞周期依賴性蛋白激酶（CDK）和細胞周期素（cyclin）[25]。研究發現DHA可導致G2/M期阻滯從而顯著抑制HCC細胞生長，cyclin-B/細胞分裂周期蛋白2激酶活性的喪失和細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C的下調可能是DHA誘導的G2/M期阻滯的原因之一[15]，因為cyclin B是細胞周期由G2期向M期轉化所必需的，它能與CDC2相互作用形成cyclin B/CDC2復合物，稱為M期促進因子[26]。Hou等[6]研究發現ART和DHA可能是通過誘導細胞周期阻滯于G1期從而來抑制HCC細胞增殖，兩種藥物均能降低cyclin D1/E和CDK4/E2啟動結合因子1水平且上調周期素依賴激酶相互作用蛋白-1/p21和激酶抑制蛋白-1/p27水平。另一項研究也發現ART使HCC細胞周期阻滯在G1期，但其機制是通過與細胞代謝相互作用來調節YAP Ser127的磷酸化和胞漿滯留，來抑制HCC細胞的增殖[27]。

值得注意的是，Ilamathi等[28]研究首次發現IL-6-酪氨酸蛋白激酶-信號轉導和轉錄激活因子（JAKSTAT）這一負反饋機制，觀察到ART是通過細胞信號轉導抑制因子3促進了負反饋環抑制機制，從而抑制了JAK-STAT信號最終達到抑制HCC細胞增殖目的。

1.4 抑制腫瘤血管生成、侵襲和轉移 腫瘤血管生成、侵襲和轉移是癌細胞擴散的主要方法。上皮向間充質轉化（EMT）是癌細胞失去上皮極性成為間質樣細胞的過程，被認為是癌癥進展過程中的始動因素[29]。Jing等[30]認為長鏈非編碼RNA（lncRNA）在HCC細胞的EMT中起著關鍵作用，進一步研究發現ART是通過阻斷HCC細胞中的lncRNA RP11/果蠅MAD基因3哺乳動物類似基因3軸來抑制EMT，從而抑制HCC細胞侵襲、轉移?；|金屬蛋白酶（MMP）和基質金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）在腫瘤的侵襲、轉移過程中擔任了重要角色，也是腫瘤血管生成和抑制的重要因子。Tan等[31]研究發現ART可通過降低MMP-2和誘導TIMP2蛋白表達來抑制HCC細胞體內外的侵襲和轉移；此外，ART可激活Cdc42增強鈣黏蛋白E（E-cadherin）的活性，從而改善細胞與細胞間的黏附狀態，顯著抑制HCC細胞轉移。另有學者同樣認為上調E-cadherin蛋白活性對DHA抑制HCC細胞侵襲、轉移至關重要，但其機制是通過下調表皮生長因子受體及其下游信號通路磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化 EPK、N-cadherin、Snail、Slug 蛋白表達水平來實現的[32]。DHA還可通過磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信號通路在體內和體外下調纖連蛋白-1和β1-整合素來抑制HCC-LM6細胞的遷移和轉移[33]。也有學者認為ART是通過調節N-cadherin-Snail-E-cadherin軸來抑制細胞遷移和侵襲的[27]。

腫瘤血管生成是由血管生成因子和血管抑制因子的失衡所致，指血管處于持續生長、重塑狀態中，最終形成畸變血管。有研究發現對于HCC，ART在體外和體內均能降低血管內皮生長因子（VEGF）和胎盤生長因子表達，VEGF是目前已知最重要的促血管生成因子，且ART在小鼠模型中可抑制腫瘤血管生成，其機制可能依賴于未折疊蛋白反應，但他們未對上游機制作進一步研究[34]。

2 ARS類衍生物聯合用藥

聯合用藥可相互增強治療效果、預防耐藥性發生、減少每單次治療使用的劑量以及減少化療藥物和分子靶向藥的不良反應。

2.1 ARS類衍生物聯合分子靶向藥 索拉菲尼（SORA）是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，具有雙重抑制、多靶點阻斷的抗HCC特點，是目前治療晚期HCC的一線用藥。但SORA的臨床療效很大程度上受到耐藥和不良反應的限制[35]。其耐藥機制可能包括EMT、PI3/AKT和JAK/STAT通路失調、低氧誘導反應和代謝重編程等[36]。因此針對聯合用藥提高SORA療效、增敏和逆轉耐藥的研究是十分必要的，ARS類衍生物對此有很大潛力。有學者提出ART與SORA的協同作用包括誘導細胞凋亡、抑制細胞遷移和抗血管生成活性，其中在誘導細胞凋亡和抑制遷移兩方面固定藥物濃度比例的聯合用藥表現出相互增強的作用[37]。另有動物實驗表明SORA與ART聯合用藥可致小鼠腫瘤生長抑制效果均顯著優于兩者單獨用藥，而其協同抗HCC機制是通過調節細胞外調節蛋白激酶（ERK）和STAT3信號轉導實現的[11]。而有其他學者認為鐵死亡才是SORA與ART聯合用藥協同作用的機制，而非細胞凋亡、壞死等，ART和小劑量SORA在體內外誘導HCC鐵死亡具有雙重作用機制即ART誘導的溶酶體激活和SORA誘導的氧化應激[24]。

先前有研究表明，在長期單一使用SORA治療的患者中，其耐藥性與組成PI3K/AKT/mTOR通路的高表達酶有關[38]。后續有學者發現SORA聯合ART治療可刺激絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶和PI3K/AKT/mTOR信號通路，這是一種促進細胞凋亡的雙重抑制作用[39]，與上述認為鐵死亡機制的研究不同。Hou等[40]發現DHA可能通過降低多肽-N乙酰氨基半乳糖轉移酶10的表達來增強SORA抗HCC作用，并其可進一步通過影響O-糖基化和PI3K/AKT信號轉導途徑直接參與抗HCC的作用。最新一項研究還顯示，軸突生長抑制蛋白B受體（NGBR）可通過激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶通路產生SORA的耐藥性，ART則可通過抑制NGBR來增加HCC細胞對SORA的敏感性[41]。綜上所述，ARS類衍生物可作為一種理想的逆轉耐藥或增敏劑，在低于毒性閾值的劑量下提高對SORA耐藥HCC的療效。

2.2 ARS類衍生物聯合化療藥物 臨床上可有效治療HCC的化療藥物并不多，比較常用的藥物有阿霉素、順鉑和氟尿嘧啶等。一項研究發現DHA和吉西他濱在體內外聯合用藥均可更明顯抑制HepG2和Hep3B細胞的生長，其療效優于ART，其機制可能是聯合用藥增強誘導了細胞凋亡[6]。而另有學者發現DHA可能通過抑制 p53（R248Q）-ERK1/2-NF-κB信號通路而降低P糖蛋白的表達，最終使p53（R248Q）表達的HCC細胞對阿霉素產生增敏效果[42]。

3 結語與展望

ART和DHA作為經典抗瘧疾藥物，具有明顯的抗HCC活性，而其與分子靶向藥或化療藥物聯合使用，可在體內和體外提高腫瘤細胞殺傷率，且對藥物增敏及逆轉腫瘤耐藥方面也有積極作用。總體而言，不管是ARS藥物單獨用藥，還是聯合用藥的協同作用，其潛在機制是相類似的，即抗腫瘤血管生成、侵襲或轉移、細胞周期阻滯、ROS累積、調節特定信號轉導途徑、誘導細胞凋亡、自噬及鐵死亡等，可能會以多種特定方式發揮作用，同時表現出幾種抗HCC的作用模式。ARS類衍生物具有高效、低毒、耐受性好、價格低廉等優點，但也存在著生物利用率低、半衰期短、水溶性差等缺點，不過當前可利用納米脂質體、金屬化合物等新型材料對ARS類衍生物進行結構修飾從而彌補這些短板。但目前有關于ARS類衍生物治療HCC的臨床研究較少，仍需多進行對照、雙盲、隨機的臨床試驗，以測試ARS類衍生物單獨或聯合用藥治療HCC的有效性和耐受性。