檢測循環細胞游離DNA用于淋巴瘤診斷和評估的研究進展

白小騰，孫曉紅，趙翔宇，李子堅

(1.蘭州大學 第一臨床醫學院， 甘肅 蘭州 730030； 2.蘭州大學第一醫院 血液內科， 甘肅 蘭州 730000)

淋巴瘤(lymphoma)是一類起源于淋巴系統的惡性腫瘤，包括霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma, NHL)。目前診斷淋巴瘤和評估腫瘤生物學特征仍然主要依賴于病變組織的組織病理活檢。化學治療前的疾病分期以及治療后的疾病評估主要依賴影像學檢查，如超聲、X線計算機體層成像(computed tomography, CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)及正電子發射計算機斷層掃描(positron emission tomography/computed tomography, PET/CT)等。組織病理活檢有些情況下面臨著取材困難的問題，而影像學評估始終面臨敏感性不足和對腫瘤負荷精確定量比較的難題。另一方面PHOENIX[1]和RUBUST[2]研究的Ⅲ期臨床研究的失敗，提示目前基于細胞起源的病理分型不能準確指導靶向藥物的治療，需要根據基因分型及相關的信號通路異常來指導各種分子靶向藥物在淋巴瘤治療中的應用。

近年來，循環細胞游離DNA(circulating cell-free DNA, cf DNA)或循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)的分析，也稱為液體活檢逐漸受到重視。在21世紀精準醫療的時代背景下，cf DNA檢測憑借其可對腫瘤進行無創、實時、全面的動態監測，同時還能夠克服傳統淋巴組織活檢取材困難的局限性等優勢，迅速成為近年來研究的熱點，在腫瘤的早期診斷、預后判斷以及治療后監測方面具有較高的臨床價值，尤其隨著新一代測序技術的發展成熟和成本大幅度下降，其在經濟成本方面的劣勢明顯減小。因此，基于二代基因測序(next-generation sequencing, NGS)技術對淋巴瘤cf DNA的檢測和動態監測，對于淋巴瘤的診斷、基因分型、動態監測、治療后評估、預后判斷具有越來越明顯的技術和經濟優勢。

1 cf DNA與ct DNA

Cf DNA，又稱無細胞DNA，屬于小片段雙鏈DNA, 這些DNA片段非常短[<200個堿基對(bp)],可存在于人的循環血清、血漿、尿液和其他體液中，由凋亡和壞死細胞釋放，在健康人群，正常器官組織來源的cf DNA中，淋巴樣細胞和髓樣細胞的脫落DNA所占比例最大[3]。血液中循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ct DNA)是cf DNA的一部分，來源于壞死或凋亡的腫瘤細胞或吞噬壞死腫瘤細胞的巨噬細胞，僅占外周血cf DNA總量的一小部分(有時<0.01%)[4]。cf DNA在健康人血清中的含量為0～100 ng/mL, 平均為30 ng/mL, 而在腫瘤患者血清中, 血清游離DNA的含量個體之間的差異比較大, 在0～1 000 ng/mL, 平均約為180 ng/mL[4]。因此通過對血液cf DNA的含量的檢測，對腫瘤早期診斷和治療后監測具有顯著的價值。

2 淋巴瘤與cf DNA的關系

健康人血液中cf DNA濃度較低，而淋巴瘤患者體內的cf DNA濃度明顯增加，分子生物學的研究證實，淋巴瘤患者血漿 cf DNA 具有腫瘤相關遺傳學改變，如微衛星改變， IgH 和TCRγ基因重排，與淋瘤組織DNA具有相同的臨床意義[5]。相關研究表明，淋巴瘤患者血液cf DNA水平(約為健康人7倍)和淋巴結炎患者 DNA 水平(約為健康人2倍)與健康志愿者相比有差異。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)明顯增高的淋巴瘤患者血液cf DNA水平明顯高于LDH正常的患者，此研究提示血液cf DNA水平反映疾病增殖活躍[6]。在初治淋巴瘤患者、治療期患者和健康人體內cf DNA水平的比較中，淋巴瘤患者初始階段的cf DNA濃度和完整性顯著高于治療階段的cf DNA濃度和完整性，并且治療期的cf DNA濃度顯著高于健康對照組的cf DNA濃度。但是，與健康對照組相比，治療階段的cf DNA完整性沒有顯著差異[7]。

原發性中樞神經系統淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma, PCNSL)占非霍奇金淋巴瘤的2%～3%和中樞神經系統惡性腫瘤的4%[8]。在25名PCNSL患者中，通過下一代基因測序(NGS)檢測PCNSL患者腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)ct DNA和腫瘤組織中相關腫瘤突變基因，檢測到基因突變匹配率分別為：MYD88 (80%)、PIM1(32%)、CD79B(28%)[9-10]。對6名疑似CNSL患者的腫瘤組織進行了NGS檢測，同時和組織病理活檢診斷進行了對比，使用NGS檢測的特異性和敏感度均為100%，此研究還使用數字PCR對CSF和血漿中ct DNA進行了基因分析，CSF中cf DNA濃度明顯高于相應的血漿樣品，同時指出，CSF中的cf DNA幾乎都來源于腫瘤細胞[10]。通過對腦脊液ct DNA的基因測序檢測，可以克服原發性中樞神經系統淋巴瘤腫瘤組織取材困難的問題，對腫瘤進行基因分型，可以針對相應的基因進行靶向治療，同時還可以進行微小殘留的監測來識別疾病復發和指導患者預后評估。

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常見的侵襲性的非霍奇金淋巴瘤之一。基于NGS方法將16例DLBCL患者的血漿cf DNA和腫瘤組織進行基因分析，對比發現，cf DNA與腫瘤組織突變的等位基因的一致性為87.5%，表明cf DNA可以在大部分患者中代替傳統組織活檢標本用于基因分析[11]。通過免疫球蛋白基因的高通量測序(high-throughput sequencing of immunoglobulin genes Ig-HTS)方法對75例DLBCL患者的311份血漿ct DNA樣本進行基因檢測，與PET-CT相比，ct DNA測序檢測的特異性更高(100%比56%)，但敏感性相似[12]。根據對DLBCL患者的免疫球蛋白受體基因重排的分析，與沒有檢測到ct DNA的患者相比，在監測期間ct DNA陽性的患者臨床進展風險顯著增高。此外，ct DNA監測方法具有較高的陽性預測率(PPV 88%)和陰性預測率(NPV 98%)[13]。15例經治療后血漿中可檢測到ct DNA的DLBCL患者的無進展生存期(progress-free survival, PFS)比10例檢測不到ct DNA患者的PFS顯著縮短[14]。還可以通過ct DNA分析以區分惰性淋巴瘤的惰性狀態與組織學轉化(histological transformation, HT)。組織學轉化是惰性淋巴瘤轉化為侵襲性淋巴瘤。比較組織學轉化的濾泡細胞淋巴瘤(tFL)和濾泡細胞淋巴瘤(FL)之間的cf DNA基因組特征，發現tFL中單核苷酸變異的比例更高，ct DNA的含量也更高。盡管在進一步的研究中應驗證ct DNA分析的效用，但本研究中計算出的PPV(91%)和NPV(80%)提示其能夠區分tFL和FL[14]。基于NGS對79例DLBCL患者的血清cf DNA分析發現87%的患者可以檢測到至少一種腫瘤相關基因突變，cf DNA檢測突變的敏感性為68%，在cf DNA樣本中發現的基因突變與組織樣本高度一致，并在43%的病例中可用于腫瘤的遺傳分類。另外，ct DNA水平與腫瘤負荷相關的臨床參數(乳酸脫氫酶和β2-微球蛋白血清水平、分期和國際預后指數)和PET-CT評估的腫瘤總代謝體積顯著相關。在接受治愈性治療的患者中，高ct DNA水平(>2.5 log hGE/mL)與較低的完全緩解(65%比96%)、更短的無進展生存期(65%比85%)和較低的2年總生存期(73%比100%)相關[15]。基于NGS對8例接受嵌合抗原受體T(CAR-T) 細胞治療后的難治或復發(r/r)DLBCL患者的血清及腫瘤組織樣本進行了腫瘤相關基因分析，發現9份組織樣本的DNA測序與同一時間點血漿中的ct DNA結果基本一致，ct DNA檢測腫瘤相關基因突變的敏感性和特異性分別為94.7%和83.3%，保持長期完全緩解的患者與復發或對CAR-T治療無效的患者相比，其血漿ct DNA突變的中位數分別為3和14.3。在連續41個月的中位隨訪中發現，cf DNA監測的趨勢與PET-CT一致，且與攜帶≥8個血清ct DNA突變的患者相比，攜帶<8個突變的患者生存期更長。因此，ct DNA有望代替PET-CT在治療后用于DLBCL微小殘留的監測，同時ct DNA測序的便利性還可以在PET-CT檢查間期實現多點監測，進一步促進DLBCL的精確治療[16]。基于NGS或PCR等技術通過對非霍奇金淋巴瘤患者外周血cf DNA的分析，在治療前用于識別基因克隆類型及腫瘤負荷的定量；治療中用于判斷療效反應的預后；治療結束后可以用于識別腫瘤清除率及預判整體生存和復發率；對于完全緩解的患者用于識別疾病復發[17]。當然，在cf DNA檢測過程中受腫瘤自身特性、實驗條件及標本等各方面因素的影響，也存在假陰性和假陽性的概率，因此還需大量的臨床數據，根據不同腫瘤制定相應的可信區間，為淋巴瘤的標準化診療提供新的更有效的檢測方法。

霍奇金淋巴瘤主要發生于青年人，老年人少見。多數來源于生發中心B細胞。經典型霍奇金淋巴瘤占所有霍奇金淋巴瘤的95%。其中兒童霍奇金淋巴瘤占兒童惡性腫瘤的5%[18]。對于HL，cf DNA分析使用了NGS和數字聚合酶鏈反應(digital polymerase chain reaction, dPCR)，NGS用于監測淋巴瘤免疫球蛋白基因突變區段，數字PCR用于XPO1熱點突變的分析，研究表明霍奇金淋巴瘤的鏡影(Reed-Sternberg, RS)細胞所產生的ct DNA也可以在血漿中檢測到[19]。在此基礎上進一步研究了霍奇金淋巴瘤ct DNA的基因分型，使用混合捕獲靶向下一代測序的方法對霍奇金淋巴瘤患者cf DNA進行基因測序，檢測到RS細胞產生的ct DNA單核苷酸變異、插入/刪除、易位和 VH-DH-JH重排，在96例患者中，有72例患者在治療前可監測到外周血cf DNA的突變，每個患者的基因變異數從1到21不等，帶等位基因頻率從0.6%到42%，突變基因中檢測到9個易位斷裂點，其中涉及JAK/STAT、NF-κB、PI3K信號傳導和抗原表達的基因最常受到影響，VH-DH-JH重排分析揭示了RS細胞大部分來源于生發中心B細胞[20]。同時在對49例正在接受化療的HL患者的研究中，43例ct DNA檢測陰性的患者，其正電子發射斷層掃描(FDG-PET)的評估也為陰性結果，在正電子發射斷層掃描顯示疾病持續存在的6例患者中，有5例患者ct DNA也為陽性。HL患者化療期間ct DNA的消失與FDG-PET陰性和患者長期無進展生存密切相關[20]。同樣，在34例經典霍奇金淋巴瘤患者cf DNA的下降水平與PET/CT掃描腫瘤體積縮小范圍成正比[21]。因此cf DNA可能代替PET-CT用于治療期間疾病的評估及腫瘤負荷的測量，同時也可以代替組織活檢用于基因分析，進一步指導靶向藥物的選擇和研發。

3 淋巴瘤ct DNA的檢測方法

3.1 免疫球蛋白VDJ基因測序(variable-diversity-joining rearrangements sequencing, VDJ-seq)

每個B細胞來源的淋巴瘤細胞都攜帶了一個單一型的免疫球蛋白VDJ基因，該克隆型重排可以作為一個“條形碼”樣的標志，通過簡單的外周血樣迅速檢測以及時發現疾病是否復發。VDJ基因克隆型高通量測序技術(VDJ-seq)可以較大范圍預測彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者的復發，甚至比常規影像學所確定的復發早數個月[12-13]。此外，VDJ-seq在診斷中可以揭示腫瘤活檢和血漿樣本之間克隆的差異性，血cf DNA高水平狀態似乎是一個可以定義高風險濾泡細胞淋巴瘤的強有力的因素[13, 22]。當然，VDJ基因重排檢測也具有很大不足，如對于免疫球蛋白陰性表型的原發縱隔B細胞淋巴瘤，以及一些具有無效VDJ基因重排的DLBCL中無法檢測，同時該技術也不適合用于確定靶向治療的靶點以及監測治療過程中抗性克隆的出現[23]。

3.2 二代基因測序(next-generation sequencing, NGS)

目前，隨著基因測序技術的不斷深入發展，二代基因測序技術也逐步取代一代基因測序成為主流的基因測序技術。該技術發展迅速，具有高通量、快速度、低成本的特點[24]。相比其他的基因測序技術，NGS無需基因克隆這一繁瑣的過程，而是將連接同一通用型高通量測序接頭的基因組DNA片段進行高通量的并行PCR及測序反應，所獲得的大量測序數據經高效能的計算機生物信息技術分析整合即可獲得完整的核酸序列信息[24]。近年來NGS也逐漸應用于淋巴瘤的精準診斷、基因異常、發病機制研究、化療后療效評估、預后評估和微小殘留的監測等方面。基于NGS的深度測序(CAncer Personalized Profiling by deep Sequencing, CAPP-Seq)方法實現了迄今為止ct DNA分析的最低背景錯誤率和最低檢測限值[25]。在一項研究中對30例接受R-CHOP方案治療的新診斷的彌漫大B細胞淋巴瘤患者使用CAPP-Seq方法測序循環cf DNA，在對標準化治療方案有應答的患者，循環cf DNA突變也可被迅速清除，而難治性DLBCL患者循環cf DNA突變持續存在，表明基于cf DNA測序檢測特征性基因突變對治療反應實時監測的有效性，敏感度達到90%，特異性達到100%[26]。使用CAPP-Seq方法對淋巴瘤患者治療前后cf DNA測序的同時使用PET-CT評估實體腫瘤大小，并比較兩者之間的相關性，從而對疾病進行動態監測[14]。總之通過NGS測序對淋巴瘤患者循環cf DNA特異性基因異常進行動態監測，可為淋巴瘤的早期診斷、治療后評估及微小殘留的監測提供新的方法，但目前該技術尚沒有用于臨床診療，其具體的臨床應用和意義還有待進一步的研究和探索。

3.3 數字聚合酶鏈反應(digital, PCR)

雖然NGS技術的時間和經濟成本已經較一代測序技術大為降低，但仍然價格不菲。數字聚合酶鏈反應(digital PCR)是近幾年新興的一種簡便、快速、經濟的核酸定量技術，只需要少量的血漿就可以對cf DNA進行分析；因此，dPCR可以成為血漿cf DNA分析的工具之一。dPCR的優點包括應用迅速、成本效益高、快速和高靈敏度和特異性，使其成為特定熱點單核苷酸變異檢測的有力工具，可以作為NGS的重要補充[23]。在實驗中將NGS和dPCR方案結合起來用于液體活檢，比較不同技術所需的成本和時間時，與NGS方案相比，dPCR工作流程方便的多，因為它需要更少的消耗品和周轉時間來監視后續研究中的特定突變。此外，dPCR能夠準確測定大量野生型DNA中的突變體DNA，即等位基因突變頻率低的DNA(> 0.1%)，通常用于NGS結果的獨立驗證[27]。因此，dPCR可以聯合NGS用于淋巴瘤cf DNA基因變異的檢測，同時可以獨立應用于NGS確定的特定核苷酸異常的動態監測，為淋巴瘤的基因診斷和ctDNA監測提供了更多可供選擇的方案。

4 問題與展望

綜上，淋巴瘤特別是DLBCL等高侵襲性淋巴瘤的基于細胞來源的病理分型已經不能準確指導靶向治療時代的藥物選擇，基于基因突變的基因分型對靶向治療選擇的意義日益突出。淋巴瘤的實體性決定病灶取材遠不如白血病等循環性腫瘤方便，為基因分型診斷和微小殘留的檢測帶來困難。在診斷時采用NGS技術對組織和cf DNA進行測序，鑒定特征性基因變異進行基因分型，并在治療后的疾病監測過程中利用dPCR技術檢測cf DNA中特定基因含量的變化，將是一個既經濟又方便的淋巴瘤基因診斷和疾病監測策略。當然，目前對于多數淋巴瘤類型來講，對其基因變異特征以及特定基因變異類型的研究都未達到可以用來準確定義疾病基因類型的程度，尚有很多工作要做。基于目前研究進展，繼續開展淋巴瘤特征性基因變異的鑒定，并不斷開展研究分析驗證其與淋巴瘤生物學特征、疾病預后的相關性，進一步制定基于NGS的基因分型策略和基于cf DNA的疾病監測策略是進一步研究的重要內容。